代谢组学

【代谢组学】3.数据分析

目录非靶向代谢组实验设计数据分析流程1.数据预处理2.数据质控3.统计分析

非靶向代谢组实验设计

1.代谢物提取,一般要求每组至少10个样;
2.在所有提取好的样本中取等量混合作为QC;
3.QC样本与实验样本穿插上机,开始十个QC,结尾三个QC,中间每十个样本穿插一个QC样本

得到质谱谱图数据经软件处理后得到峰表。
峰表格式一般为:每行为一个m/z,每列为一个样本
数值表示该样本中某个m/z的信号响应。
image.png

第一列为保留时间_质荷比来代表离子,如0.10_96.9574m/z。

数据分析流程

一般有如下几点:
1.数据预处理。如缺失值过滤填充、数据归一化等。
2.数据质控。包括CV分布、QC等。
3.统计分析。包括单变量、多变量等。
4.功能分析。包括Pathway、网络分析、Biomarker筛选等。

1.数据预处理

缺失值处理
1)缺失原因
a. 信号很低检测不到;
b. 检测错误,如离子抑制或者仪器性能不稳定;
c. 提峰的算法限制,不能从背景中将低的信号提取出来;
d. 解卷积时不能将重叠的峰全部解析出来。

2)缺失值过滤
比如:
QC样本中缺失超过50%的去除;
样本中缺失值超过80%的去除。

3)缺失值填充
-- 最小值填充
-- 平均值/中值填充
-- KNN( k-nearest neighbour)填充
-- BPCA(Bayesian PCA)填充
-- PPCA(probabilistic PCA)填充
-- Singular Value Decomposition (SVD)
一般推荐KNN。

噪音信号去除
一般是低质量的离子。
1)低质量离子的确定:
计算某个离子在QC样本中的RSD(标准差/均值);其值越小,说明偏差越小;

2)判断标准:
-- 对单个离子峰而言,RSD 0.3,则该离子峰合格,否则去除;
-- 对于整体数据而言,RSD 0.3,峰所占比例 60%,则整体数据合格;

样本归一化
目的是为了提高样本间的可比性。
样本间有差异性,如不同人的尿液浓度不同,不能直接拿来比较。

可在采集前归一化,如肌酸酐归一化;也可在采集后归一化,如sum,pqn,quantile等。对于数据分析而言,通常是后者,如总和归一化(sum)。

数据转换
下游的分析一般要求数据为正态分布或者高斯分布;
所以数据通常要进行Log转化或power转化,这两者都能够将极大值的抑制效应消除,并且能够调整数据的分布,如下图;

image.png

Log转化对0值比较敏感,必须首先去除零值。

数据转换——scaling
目的是消除极大值效应。
对不同样本中同一个m/z的强度差异过大进行调整,极大值的存在往往会掩盖较低值的变化特征。

可将某个m/z在所有样本中的强度的值,除以一个因子(SD值);
方法如auto (uv),pareto(推荐),vast, range等。

相当于上面样本归一化是为了样本可比,scaling是为了离子可比。

2.数据质控

QC样本的TIC重叠情况
image.png
上图分别是阴离子和阳离子模式下QC样本的TIC重叠情况。

一般认为:
所有的QC样本峰重叠良好;
峰强度波动差别不大;

QC样本中CV 30%的峰所占比例
image.png

PCA中QC样本的聚集程度
image.png

QC样本的相关性
image.png
上图分别为归一化前和归一化后的数据。

3.统计分析

单变量分析
一次只分析一个变量,即一个m/z,考察不同组别不同样本的这个m/z表达有无差异?
常见的方法有倍数分析,t检验,秩和检验,方差分析等。

聚类分析
核心思想就是根据具体的指标(变量)对所研究的样品进行分类;
聚类分析需要设定一个方法来衡量样本间的相似性或者不相似性(常用欧式距离,相关性系数等);
常见聚类的方法:系统聚类(层次聚类)、K-均值聚类等。

K-均值首先要估计出将要分出几个类,然后将全部的基因按照相似性的距离,归入这几类中。
K– means计算量要小得多,效率比层次聚类要高。

无论哪种分类方法,最终要分成多少类,并不是完全由方法本身来决定,研究者应结合具体问题而定。
聚类分析是一种探索性的数据分析方法。相同的数据采用不同的分类方法,也会的得到不同的分类结果。分类的结果没有对错之分,只是分类标准不同。
使用聚类方法时,首先要明确分类的目的,再考虑选择哪些变量(或数据)参与分类,最后才需要考虑方法的选择。

多变量分析
1)PCA分析
以下分别是得分图(样本在新的坐标系中的位置
)和载荷图(loading图,原变量与主成分间的夹角)
image.png

PCA怎么看?

PC1与PC2得分

2)偏最小二乘法
PLSDA的图和PCA类似。只是一种监督学习的方法,事先给样本分类,最后看能否将不同组分开。

用R2和Q2进行模型评价。
R2是相关性系数,表示这个模型的拟合效果,是一个定量的测量(范围0-1),意味着所建立的模型能在多大程度上代表真实的数据;
一般当R2在0.7-0.8表示模型解释能力较好,较差的模型的R2往往为0.2-0.3

Q2表示PLS-DA模型的预测能力;
一般Q2大于0.5表示预测能力较好,并且R2与Q2的值应该比较接近。

使用permutation test模型进行过拟合检验。

VIP ( Variable Importance in Projection)变量重要性投影
每一个m/z都有VIP值,表示这个m/z在某一个主成分上的投影,即重要程度;
一般我们使用第一、第二主成分的VIP来表示这个m/z对模型分型的贡献程度,VIP =1被认为是具有显著贡献的。

代谢组学数据分析最后两部分内容——功能分析和生物标志物筛选见下节内容

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