蛋白质组学

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT

定量蛋白组学的研究意义

人类基因组完整图谱于2003年正式公布,这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成,生命科学研究也进入了后基因组时代。这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制,设计基因药物,进行医疗。但是时隔十多年过去了,效果远没预期的理想。其中主要原因可能是,我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来,逐渐成为研究热点之一。定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的蛋白质进行鉴定和定量的学科,是蛋白组学研究的重要分支。

基于质谱的蛋白质定量

20实际80年代中期出现了MALDI(基质辅助激光解吸附电离)和ESI(电喷雾电离)两种软电离方法,可以将蛋白质或者多肽离子化,从而引入质谱仪种进行定性和定量分析,从此生物质谱技术成为蛋白组学重要的分析工具之一。

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT

图1. 生物质谱仪器。

利用生物质谱技术,主要有两种蛋白组学研究策略:

Top-down strategy:Top-down(自上而下法)通常的做法是,先利用二维凝胶电泳分离蛋白,再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析,借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对,从而实现对蛋白的鉴定。

Bottom-up strategy:Bottom-up(自下而上法)通常的做法是,先将样品用酶进行处理,多维色谱分离后引入质谱分析,再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对,最后实现对蛋白的鉴定。

蛋白定量分为相对定量和绝对定量,由于电泳技术具有重复性差等缺点,而多维色谱能将样品酶解物稳定分离,因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。虽然绝对定量似乎更为理想,但是绝对定量更为复杂和昂贵,而相对定量在很多时候就能满足科研需求,因此,相对定量更为常用。利于质谱技术,可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量,主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学(标记定量和非标记定量)和靶向定量蛋白组学。

标记定量

标记定量主要分为体内标记(SILAC)和体外标记(iTRAQ,TMT)。

1 SILAC

SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture) 的基本原理是通过培养,利用天然同位素(轻型)或者稳定同位素(中型/重型)取代相应氨基酸。经过5-6次传代后,稳定同位素可以完全掺入到新合成的蛋白质中。不同标记的细胞或者蛋白等比例混合后,引入质谱鉴定。如果峰值呈现为1:1,则表示此蛋白的含量无差异。如果含有重型氨基酸的峰值偏高,说明重型氨基酸标记的组中此蛋白含量更高。SILAC的优点是蛋白标记效率高,传代6-8代后,灵敏性高。可检测水平低的蛋白含量变化和翻译后修饰,且样本需求量小,每个样本仅需几十微克,缺点是耗时长。

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT

图2 SILAC原理和流程。

2 iTRAQ TMT

iTRAQ(isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation)和TMT(tandem mass tag)是目前应用较为广泛的蛋白质定量方法之一。两个方法的原理类似,都是化学体外标记方法。由于生产商不同(iTRAQ的生产商为为AB Sciex, TMT的生厂商为Thermo Fisher),所以标记规格和标签分子结构有差异。这两种方法可检测出低丰度的蛋白,胞外蛋白,膜蛋白,胞浆蛋白,核蛋白等,可同时处理多个样本,鉴定和定量的结果同时得出且准确,适用比较蛋白组分析,鉴定差异蛋白。

表1. iTRAQ和TMT标签的差异。

标签 生产商标签规格 iTRAQAB Sciex4标,8标TMTThermo Fisher2标,6标,10标

iTRAQ原理:首先蛋白质被裂解形成多肽,然后利用iTRAQ试剂进行差异标记。iTRAQ标签包含报告基团、平衡基团和肽反应基团。不同标签的报告基团和平衡基团重量有差异,以4标为例,报告基团重量分别是:114,115,116,117Da,而平衡基团重量分别为31,30,29,28Da。因此,标签的总重是一致的。同一肽段由不同标签标记后具有相同的质荷比。串联质谱中,碰撞诱导质量平衡集团丢失,因此同一多肽由于标签不同,产生不同的报告离子,根据报告离子的信号强度从而推断不同样品间相同肽段的含量。

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT

图3 iTRAQ技术流程。

非标记定量

非标记(Label free)蛋白质定量利用液质联用技术将蛋白质酶解形成多肽后进行质谱分析,通过计算蛋白肽段的鉴定数目和色谱峰面积进行蛋白质相对定量。该方法的优点是无需昂贵的标签做内标,且样本制作过程简单,由于操作步骤少,可尽量减少人为和系统误差。但是数据分析相对标记定量而言难度更大更复杂,且重复性较差,对仪器的稳定性和重复性要求高。通过在样本中添加已知含量的标准蛋白还可以实现绝对定量。

非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT

图4 Label-free蛋白定量流程。

参考文献:

代立朋. 基于液质联用法的蛋白绝对定量技术开发及其在单抗类药物临床前药代动力学研究中的应用[D]. 天津大学, 2014.

基于质谱的定量蛋白质组学技术发展现状[J]. 生物技术通报, 2017(9).

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