蛋白质组学

蛋白质泛素化及其检测方法简介

1.泛素

泛素广泛存在于真核生物中,是由76个氨基酸组成的多肽,泛素的氨基酸序列高度保守,如果这些序列发生突变,功能就会受到影响,生命体就不能存活或者被自然选择所淘汰,所以它在生物的进化过程中非常稳定。比如人类和酵母的泛素只存在三个残基的区别。

泛素空间结构模型
泛素空间结构模型

2.泛素化修饰

通过一系列的酶发挥作用,使得一个或者多个泛素分子和底物蛋白质的分子发生共价结合的一种蛋白翻译后修饰过程,我们称之为泛素化修饰。蛋白质的泛素化修饰是生物体内重要的翻译后修饰之一,在蛋白质降解、DNA损伤修复、细胞自噬、胞吞作用、炎症反应等众多生物学过程中均发挥重要调控作用。

最初发现泛素化修饰的功能是它能够对靶蛋白进行标记,从而让靶蛋白被蛋白酶体识别并且降解,这个过程就涉及到多种酶系统、泛素分子以及底物蛋白。

泛素-蛋白酶体系统(UPS)包括:泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3,以及去泛素化酶和蛋白酶体。

泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3
泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3

泛素-蛋白酶体系统(UPS)的作用:能够迅速降解掉那些不正常的蛋白,还有那些短暂控制一系列基本的细胞生命活动的调节蛋白,这个系统是具有高度特异性的,那么细胞是如何选择选择并且高度特异地降解掉蛋白呢?它是通过给需要降解的蛋白加上泛素这种标签,继而被识别降解。

 

3.蛋白质泛素化降解的过程详解

泛素化降解蛋白质需要通过泛素化蛋白酶体来实现,蛋白酶体存在于细胞质和细胞核,是一种由十到二十个亚基组成的蛋白复合物。在生物细胞体内普遍存在的是26s蛋白酶体,它的组成分为两部分,一部分是20s蛋白酶体,是核心的成分,另一部分是两个19s蛋白酶体,起调节作用。细胞内的大部分蛋白质都是由26s蛋白酶体降解的。靶蛋白的泛素化降解是经过几个连续的过程来完成的:

①在ATP供给能量的情况下,泛素激活酶E1将泛素分子活化;

②泛素激活酶E1将活化的泛素分子传递给泛素结合酶E2;

③泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到靶蛋白上;

④26s蛋白酶体特异性地识别这个带有泛素标签的底物蛋白,将其降解掉。

泛素化过程图解
泛素化过程图解

总的来说,靶蛋白是在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的依次作用下共价连接上几个泛素分子,最后被26s蛋白酶体特异性地识别并降解成小肽,泛素在去泛素连接酶的作用下进行回收利用,这些小肽再被细胞质中的蛋白酶降解为氨基酸。

4.如何检测蛋白是否泛素化

1.western blot and immunoprecipitations

通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

2.western blot and strip

通过western blot检测所有发生泛素化的蛋白条带,拍照后,将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应,显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。

3.in vitro ubiquitin-binding assay

将我们要研究的蛋白(被泛素化的蛋白)基因转染293细胞,大量表达后提纯。或者直接提取内源性蛋白。在体外与K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育,然后通过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。

4.in vitro ubiquitination assay

将要研究的目的基因转染293细胞,使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1,UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ,HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白B(引起蛋白A泛素化的蛋白),共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。

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