蛋白质组学

蛋白互作分析技术总结

蛋白质组学是一种大规模的蛋白质分析方法,它对我们理解后基因组时代的基因功能具有重要意义。蛋白质组学可分为三个主要领域:(1)用于大规模鉴定蛋白质的蛋白质微观特征及其翻译后修饰;(2)差异显示蛋白组学,比较蛋白水平在多种疾病中的潜在应用;(3)利用质谱或酵母双杂交系统等技术研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。蛋白质组学在系统生物学工作流程中起着重要作用,是对转录组和代谢组分析的补充。例如,目前很难从mRNA的丰度来预测细胞蛋白浓度,尽管有研究发现转录水平与所有蛋白质的子集丰度呈正相关。当蛋白质在体内发挥其功能的时候不是各司其职的单干,蛋白质们会通过相互作用形成复合体然后进行团队合作,在工作的过程中,蛋白质们也会更改相互作用的伙伴,进而改变蛋白质复合体的功能。人们将蛋白之间的互作(PPI)构建成网络如图1,以此来了解细胞生命活动的过程,对调控细胞及其信号有重要意义。

蛋白互作网络

图1. 蛋白互作网络

因此,研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的重要的环节之一。如果我们要研究一个蛋白与另一个蛋白或另外一些蛋白是否具有相互作用,首先就要先找到这个蛋白,再从中找到其他相关联的蛋白,最终达到我们的实验目的。研究蛋白互作的方法可谓是五花八门,今天就带大家了解相关的实验方法。

一、 酵母双杂交系统

酵母双杂交,Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的时候利用大肠杆菌中 GAL4 乳糖操纵子的原理,开发出这个方法用于检测蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交系统是一种体内方法,用于识别编码蛋白的新基因与感兴趣的蛋白相互作用。该系统提供了一些识别相互作用的蛋白质超过传统的生物化学方法。该双杂交系统是检测相互作用蛋白的遗传和分子方法,该检测是在体内而不是在体外进行的,这使得检测相互作用蛋白的天然结构成为可能。因此,双杂交系统具有高灵敏度,以检测微弱和短暂的蛋白质相互作用。

值得注意的是,酵母半乳糖代谢途径的全局转录激活因子GAL4由DNA结合域(DNA-BD)和激活域(AD)组成。DNA-BD识别并与gal4反应基因上游区域的一个序列(UAS)结合,而AD则与启动转录所需要的机制的其他组件相联系。这两个区域的存在,如果是物理隔离,则不足以激活反应基因。

因此,在酵母双杂交系统中,两个GAL4结构域分别被编码相互作用蛋白的基因所分割,重组杂交蛋白在酵母中表达。这两种杂交蛋白的相互作用使两个GAL4结构域足够接近,形成一个功能激活因子,激活报告基因的转录,使蛋白质相互作用表型可检测,即lacZ 的表达,使得人们可以检测到,如下图。

 酵母双杂交原理示意图

图2. 酵母双杂交原理示意图

二、 Co-IP GST pull-down

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是用于研究蛋白互作的方法。它的优点是直接有效,以抗原抗体特异结合为原理。细胞内天然存在PPI。我们首先将细胞破碎裂解,再将我们的目的蛋白的抗体预先结合在agarose beads上,用这样的agarose beads与我们的细胞破碎产物孵育一段时间后回收。再通过跑PAGE,对与目的蛋白互作的蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。

GST pull-down与Co-IP方法类似,不同之处在于GST pull-down是体外研究蛋白互作,而Co-IP多用于细胞内互作。该方法利用一种带有GST-Tag的融合蛋白来拉互作的蛋白,然后用可结合GST标签的琼脂糖珠将融合蛋白吸附沉淀,经SDS-PAGE分离,同理我们也可以把其他标签加在蛋白,比如Strep、FLAG、MYC等。但是这种方法无法说明蛋白天然互作的情况。

 Co-IP过程

图3. Co-IP过程

三、 串联亲和纯化-质谱

无论使用哪种标签作为诱饵蛋白来拉我们要找的蛋白都只能起到一个粗提作用,当这个蛋白是已知或是实验前推测有联系时,我们可以做Western Blot进行验证,但是如果发现一种新的未知互作关系时就需要一种高通量、高分辨率的技术,这就是质谱。

亲和纯化步骤与Co-IP一致,但单标签纯化效率低下,而且残留的杂蛋白较多;因此逐渐发展成为双标签纯化。亲和纯化可以采用两种标签组合,但值得注意的是,并没有一种标签组合是百分百理想的。标签的选择主要是根据标签的特性,目的蛋白本身的属性,比如稳定性、可溶性,以及标签与目的蛋白的融合性。将亲和纯化得到的蛋白复合物联合质谱技术进行鉴定。

四、 表面等离子共振

自20世纪80年代初,表面等离子体共振首次被用于金属表面过程的研究和气体传感以来,SPR生物传感器已成为表征和定量生物分子相互作用的重要工具。此外,用于检测化学和生物物种的SPR传感器的发展也得到了发展,用于检测与医学诊断、环境监测、食品安全和安全有关的分析物的SPR生物传感器的出版物数量也在增长。

表面等离子体共振原理

图4. 表面等离子体共振原理

与上述这些非成像技术相比,该成像技术在空间上解析蛋白互作,允许使用高通量微阵列技术对蛋白进行详细研究,并对不同的蛋白进行多路检测,而不会损害敏感区域。荧光检测是一种应用广泛的成像技术,它可以对标记有染料分子的蛋白进行成像。然而,无标签技术是需要的,因为它们消除了标签对蛋白功能的可能影响。重要的是,与基于标签的方法不同,无标签技术直接测量蛋白的内在物理特性,提供额外的信息,如每个蛋白的质量和大小。表面等离子体共振成像(SPRi)是一种无标签的原位检测和分子结合研究技术。

参考文献:

Shtenberg, Giorgi, et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Analytical Chemistry 85.3(2013):1951-1956.

Grashoff, Carsten, et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature 466.7303(2010):263-266.

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