蛋白质组学

ELISA实验的详细步骤、所用试剂及注意事项?

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断,也可应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点,不仅适用于临床标本的检查,适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,作为一种早期诊断方法,ELISA法在生物医学各领域也有着广泛的应用。
详细操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
  2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
  3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
  4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
  5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
  6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

  方法二 用于检测未知抗体的间接法: 
  
  用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

       试剂器材

  1. 试剂

  (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59克 NaHCO3  2.93克  加蒸馏水至1000ml  
        (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
  (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5~10%使用。
  (4) 终止液(2M H2SO4):蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。
  (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。
  (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75%H2O2 32μl
  (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3%H2O2 2μl
    (8)   抗原、抗体和酶标记抗体。
    (9)   正常人血清和阳性对照血清。

  2. 器材:

  (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔,ELISA检测仪,50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。
  (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
  (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。
 
Elisa 注意事项

  1. 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

  2. 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

   (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

  (2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

   (3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

   (4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。

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