蛋白质组学

Western blot实验之SDS-PAGE操作失误汇总!

       本文用图例指出跑胶是最容易犯的多种错误(当然这些错误仍在更新之中),每一个例子都配有完整的凝胶图像和与之相对的解释及建议,和这个小册子收集的实例比对,希望你应该能够找到解决你的问题的正确的方法。
       
第一部分:涂抹痕迹(smears)
       涂抹痕迹可能由于多种原因引起,但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。这块胶倒胶不正确,在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶,不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液,然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。(我推荐重新倒胶,制胶很关键,如果你后续还要做blot,胶没有跑好浪费太多了!)
        
第二部分:条带过浅
      这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中。最有可能原因是由于装置没有正确紧密的装配导致较多的样品溢出加样孔。溢出的样品很可能不会重新溶入形成条带,因为这些蛋白从上层缓冲液的间隔持续进入凝胶。
       第三部分:前端指示剂缺失
      为了置凝胶花了不少功夫,如果停止电泳太晚就太可惜了。因为如果部分前端的指示剂已经跑出凝胶的话就不能确定各个条带相对应的迁移率了。这块胶有一个内部的刻度——也就是跑胶时带上了分子量标准(Marker)。由于条带较平直,任意条带都可以作为参考来确定跑胶的迁移率。
        第四部分:过早终止电泳
      很明这块胶的指示剂前端位于什么位置。仍有继续电泳的空间可以把条带分得更开以增加分辨率。相对迁移率是为了分析凝胶相同位置上相同大小的蛋白。随着蛋白迁移距离的增加分辨率逐渐增高直到弥散限制了分辨率的继续提高。
          第五部分:混在因素
     这个问题的凝胶在整个“失误大全”中到处可见。这是由于分离胶的表面不平所造成的,因此当样品浓缩之后所有的条带都变扭曲的形状。扭曲的条带也可以见于电场的不均一,但是这种条带的扭曲应该是对称的。
      

 

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