蛋白质组学

PRM蛋白质定量

PRM(平行反应监测, Parallel Reaction Monitoring),靶向蛋白质组,是一种基于高分辨、高精度质谱的靶向定量技术,能够对目标蛋白质/肽段(以及含有修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段的精准定量。

技术原理
应用范围
实验流程
样品要求
案例展示

基于高效液相色谱的鸟枪法蛋白质组学(LC-MS/MS)具有强大的蛋白质定性能力,但是在蛋白质定量上,其灵敏度仍待提高。而近来兴起的靶向蛋白组学技术,在蛋白质定量上灵敏度更佳,重现性更好。如果鸟枪法蛋白质组学是对样品进行大规模的盲筛,那么靶向蛋白质组学就是有针对性的对一组已知的感兴趣蛋白质,进行高质量的靶向定量。 SRM(选择反应监测,也称为MRM)是靶向蛋白质组学的金标准,而它的衍生技术,PRM(平行反应监测)则在最近刚刚兴起。PRM技术依赖于高质量精度/高分辨率的质谱仪,因此其靶向定量的结果与SRM相比而言,选择性更高,灵敏度更佳,重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力更强。

PRM技术基于Q-Orbitrap为代表的高分辨、高精度质谱平台,首先利用四级杆质量分析器的选择能力,用Q1选择目标肽段的母离子,随后在collision cell 中对母离子进行碎裂, 最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

技术特点:

1. 灵敏度、重现性和准确度高,定量范围可达到5个数量级,定量重现性CV<10%, 相对误差<15%。
2. 与经典的Westernblot、ELISA 技术相比,不需要使用抗体,获得更为准确和重现的定量验证结果。
3. 在一个小时检测时间内可同时实现50个蛋白质的定量检测。
4. MRMHR/PRM可直接检测二级所有离子,减少了子离子的挑选和优化过程。

1. 目标蛋白质/肽段相对或绝对定量,蛋白质翻译后修饰的定性定量研究。
2. 定量蛋白质组学(iTRAQ、label-free、SILAC)后,目标蛋白需验证。
3. 使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物。
--对目标蛋白的定量确实两种方法都可以实现,有意思的是PRM也常被称为“质谱领域的WB”。WB是依赖于抗体的检测方法,其效果与抗体的质量、实验操作密切相关,而且严格说来,其基于显色条带亮度的定量只能说是“半定量”。目前市场上抗体质量参差不齐,很多蛋白又没有商品化抗体可以购买,制备单抗周期又长,这些因素很大程度上限制了WB的效果。PRM则是一种不依赖抗体,基于质谱的靶向定量技术,所以对一些没有抗体的蛋白,以及针对翻译后修饰的蛋白,通过PRM可以很快拿到定量结果。PRM灵敏度高,特异性好,定量范围可达4个数量级以上,实现了真正意义上的蛋白精确定量。另外,通量方面,一次PRM实验可同时对多达几十个蛋白进行同时定量,这也是WB很难达到的。


4. 有多个蛋白质需同时定量。
5. 功能研究中涉及到蛋白质定量。
6. 使抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。

样品要求:
蛋白提取物:≥50μg
细胞:≥106
组织:动物组织≥1 mg,植物组织≥10 mg
体液:血清≥5μL,脑脊液≥10μL

 

 

1.肽段相对/绝对定量
案例中使用靶向的SRM技术(与PRM思路操作基本一致),利用已知浓度内标肽段做标准曲线,实现未知样品中目标肽段的绝对定量。
https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_absolute_quant

2.蛋白相对定量
文章利用标准蛋白和复杂生物样品,对PRM技术进行了细致地评估,并采用Scheduled方法提高检测通量,显示出PRM技术的巨大应用前景。
Multiplexed, Scheduled, High-Resolution Parallel Reaction Monitoring on a Full Scan QqTOF
Instrument with Integrated Data-Dependent and Targeted Mass Spectrometric Workflows. Anal Chem 2015, 87(20): 10222-10229

3.蛋白磷酸化修饰定量
文章中通过定量磷酸化蛋白质组学技术得到癌症病人样品中的蛋白磷酸化的变化,然后用PRM技术对挑出的目标蛋白磷酸化位点的变化进行更精准地定量和验证。
Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci
U S A 2017, 114(12): 3175-3180

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