蛋白质组学

二肽的概念与二肽合成的个人心得体会

一个氨基酸羧基与另一个氨基酸的氨基失水形成的化合物成为二肽,二肽是最简单的多肽。本文总结了二肽的基础知识以及二肽合成的经验。

二肽的基础知识

二肽的概念

二肽(dipeptide )是二胜肽的最简单的肽,由一分子 氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键(即-CO-NH-)组成的蛋白质片段或物质。其分子中仅包含一个肽键。它们是一大类物质的统称。

二肽举例

如由一个含有游离的α-氨基的甘氨酸残基和一个含有游离的α-羧基的丙氨酸残基组成的二肽叫甘氨酰丙氨酸。

制备与保存

蛋白质可由酸、碱或酶水解,在水解过程中蛋白质逐步降解成为蛋白胨、多肽、三肽和二肽等越来越小的蛋白质碎片,直到最后成为氨基酸混合物。

在体内二肽通常能被二肽酶所水解而成为两个游离氨基酸。在体内肠黏膜细胞上也存在着吸收二肽或三肽的耗能主动运转体系,故有二肽吸收入细胞先于游离氨基酸之说。

二肽是一种化合物,是天然氨基酸即阿尔法氨基酸(氨基连在连有羧基的碳上)中的氨基于羧基脱水缩合而成的。其中只含一个肽键即-CO-NH-。可水解。

肽大多性质不稳定,长期贮存宜防潮,放在4℃以下的地方。

医学和商用价值

活性肽,与营养,荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫 、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常紧密关系。

合成二肽工作中些许心得

最近一直在做合成N-Boc-L-His-L-Thr-OMe的实验,刚读研一的我来到实验室,看着凌乱的玻璃仪器,油腻的桌面,而且旋蒸的压力一点也上不去,看到这些心就凉了一半。刚开始的我不敢向导师提出任何要求,就这样按着老师给的方案(方案是两年前师姐用色氨酸和苏氨酸合成二肽的实验。)开始了,实验方案如下:

(1)合成N-Boc-L-Tryptophan色氨酸的合成

在150ml单口瓶中加入2.04g的L-色氨酸,80ml的10%的三乙胺甲醇混合溶液,搅拌溶解。随后加入叔丁氧碳酸酐4.35g,控制温度在55℃以下反应30min。反应完后,有机相减压蒸馏,蒸出大部分的三乙胺甲醇混合溶液。剩余的溶液在冰水浴下用10ml的盐酸酸化至pH=2,再用乙酸乙酯萃取(60ml×3),合并有机相并用80ml的饱和食盐水洗涤,无水MgSO4干燥,过滤,蒸除溶剂得到淡黄色的固体。

(2)L-Tyrosine-OMe L-酪氨酸甲酯盐酸盐的合成

向装有回流冷凝器的150ml单口瓶中加入50ml无水甲醇,冰水浴冷却下10min内地家乙酰氯6ml,并继续搅拌5min。将酪氨酸2.5g一次性加入,然后缓慢升温至回流,反应3小时。蒸除溶剂得到产品L-Tyrosine-OMe盐酸盐备用。

(3)N-Boc-L-Trypophan-L-Tyrosine-OMe

将L-Tyrosine-OMe盐酸盐2.31g溶于15mlDMF,加入3ml的三乙胺,搅拌反应15min,加入3.05g的N-Boc-L-Tryptophan色氨酸和二氯甲烷的溶液,滴加5.67gN,N-二环己基亚酰胺(DCC)溶于10ml二氯甲烷的溶液,反应4小时,过滤。滤液减压浓缩,加入乙酸乙酯和水,水层以乙酸乙酯提取。将提取液与有机层合并,用10%柠檬酸、饱和食盐水、饱和碳酸氢钠依次洗涤。将液体干燥、浓缩,加入石油醚结晶。

当按着实验做第一步时,就遇到了问题,查阅了相关文献,并且得到虫子上高手的指点,后来又问了导师,才明白其中的一些原因:师姐论文上的方案改动过,并不是实际方案,当时我感觉好凄凉,悲哀啊,我也明白是导师下令让改的,目的想必大家都清楚。

我想导师也没想到吧,他这样做的后果是:吃亏,浪费经费的是他的下下界学生。另外我个人还觉得可能还有其他原因,就是师姐做的色氨酸的方案不适合组氨酸,不过从(BOC)2保护氨基酸氨基的普遍方法来看,原方案确实不妥,而且组氨酸很难溶于三乙胺溶液。所以基本可以否定原方案了。

接下来按着修改过的方案做:

L-His溶于THF:水(1:1),室温搅拌5min,加入NaOH溶液是PH为9~10,冰浴至0℃,在1小时~1.5小时内滴加(Boc) 2O,滴加完毕,冰浴下继续搅拌2小时,然后缓慢升温至室温,反应20小时后,冰浴下调PH为7,减压蒸除THF,用稀盐酸调PH为2~3,用乙酸乙酯(60ml×3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水洗涤,然后用无水MgSO4干燥,过滤,减压蒸馏的粘稠状固体。

但产率实在太低,而且反应过程没找到合适的展开剂,因此无法检测反应。

因此又制定了方案II

250mL反应器,加入水和二氧六环各60 mL,再加入L-组氨酸(4. 0 g, 25. 78mmol) ,

用冰浴冷却至0 ℃,然后加入(Boc)2O (12.376g, 56.71 mmol) ,缓慢加入NaOH溶液,保持容液PH为8~9,自然升至室温,反应20h. 减压去除二氧六环,水相用乙醚提取两次,然后以饱和KHSO4 调节pH = 1~2,乙酸乙酯萃取三次,饱和NaCl溶液洗涤有机相,无水Na2 SO4 干燥,然后减压蒸干,得到淡黄色粘稠物。

可是问题又出现在我自身上,由于我把一小打pH试纸放在抽屉中,没有放入小袋中,而是长期暴露于空气中,导致失效,可我没注意到这一点,导致调pH值时调过了头。结果Boc从氨基上脱落。

在实验中观察的现象是长期暴露于空气中的pH试纸,首先颜色比原色稍白,调pH到4以下,试纸曾现暗灰色,所以4以下就没法辨别pH值了。

由于在做第一步时否定了原定方案,接着自己对原定方案的第二步的可行性产生了怀疑,于是再次求助于小木虫,得到了虫子们的热情帮助,肯定了原实验方案的可行性,并且让我明白了其中的反应机理,获益匪浅。

接着开始了第三步,先是查阅大量文献(在这次查阅中得知第一步中的反应物的量对反应有着显著的影响,即是否应该把咪唑上的氨也保护的问题。),通过比对文献以及文献中与原实验方案第三步的不同之处,制定了新的方案:

N-Boc-L-His-L-Thr-OMe的合成

称取N-Boc-L-His10mmol 溶于四氢呋喃(THF),冰水浴冷却,冰水浴中缓慢加入DCC 10.8mmol,HOBt 10.8mmol ,冰浴冷却(溶液1) ,磁力搅拌; 称取L-Thr-OMe 2 mmol 和0.3mL 三乙胺溶于适量的THF溶液中(溶液2) ,将溶液2 和溶液1 混合,并在0℃下搅拌10 h。TLC 显示原料点消失。停止反应,抽滤。滤液减压浓缩,溶于乙酸乙酯,分别用质量浓度为饱和碳酸氢钠、饱和柠檬酸溶液各洗两次,饱和氯化钠溶液洗涤一次。取有机相,用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏,石油醚结晶。

做实验中:

1、发现L-Thr-Me不溶于THF中,加入适量DMF,才溶解掉。

2、减压蒸馏后发现大量暗黄色物质。

3、结晶后暗黄色物质与针状结晶一并析出,于是溶解热过滤,导致产物大量损失。原因可能是:

a、没有按虫友们说的DCC与HOBt的比例应为1.2:0.8加量。

b、用饱和碳酸氢钠、饱和柠檬酸溶液各洗两次,饱和氯化钠溶液的洗涤不够彻底。

c、在实验中发现乙酰氯滴到醇或水上时,产生爆鸣,由此乙酰氯在常温滴到醇或水中时,可能会爆炸。

d、还发现柠檬酸稀释为吸热反应,杯底冰凉。

f、还明白了放久了的1,4-二氧六环放久了旋蒸不会爆炸。(当然旋蒸完要慢慢放气)。

本次实验中,虽然产率很低,但作为初次独立做实验的我来说,还是学到了很多,而且在实验室我还领悟到了学做实验,其实也是在学做人,我学到的东西就是:虽然导师的方案有不妥,但你尊重他,导师不但不会责怪你,还会尽最大努力支持你,我实验室欠缺的仪器和损坏的仪器,导师都给买了,虽然比不上那些好学校的实验室,但比刚到实验室时有了很大改观。

肽键的合成包括三个步骤即:制备部分的保护氨基酸、使N-保护氨基酸的羧基处于活化状态、对保护氨基进行选择性的脱除(二肽合成中保护基要全部去除)。以上是近几个月来做二肽合成的个人经验,分享下供大家交流。

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