蛋白质组学

大肠杆菌蛋白表达纯化策略

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在,需要不同的纯化策略。现在,许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能,这些自然需要将蛋白质分离出来后,进行进一步的研究来获得。
 
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认,蛋白质纯化比起DNA 克隆 和操作来是更具有艺术性的,尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的),但它却有标准的物理化学性质,而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。
 
正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化,但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是,尽管存在这种固有的困难,但现已有多种方法可以利用,蛋白质纯化策略也已实际可行。目前,待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier 等发展的以噬菌体T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(over-expression),表达水平可达细胞蛋白的2%以上,有些甚至高达50%。
 
一、可溶性产物的纯化
 
(一)试剂准备
 
采用T7· Tag Affinity Purification Kit(T7·Tag 抗体琼脂)
 
大肠杆菌蛋白表达纯化的策略
 
(二)操作步骤
 
1.  100 ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000 g×5 min,弃上清,收获菌体,用10 ml 预冷的B/W 缓冲液重悬。
 
2.  重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4 ℃离心 14000 g×30 min,取上清液,0.45 μm膜抽滤后作为样品液。
 
3.  将结合T7·Tag 抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。
 
4.  B/W 缓冲液平衡后样品液过柱。
 
5.  10 ml B/W 缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。
 
6.  用5 ml 洗脱缓冲液过柱,每次1 ml,洗脱液用含150 μl 中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE 分析。
 
7.  将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24 hr,中间换液数次。
 
8.  用PEG 20000 浓缩蛋白。
 
(三)注意事项
 
蛋白在过层析柱前,要0.45 μm 膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。
 
二、包涵体的纯化
 
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态
 
的聚集体,不具有生物学活性,因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95%,此外,还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA 聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。
 
(一)试剂配制
 
1.  缓冲液A:50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl。
 
2.  缓冲液B:50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,1%NP-40。
 
3.  缓冲液Ⅰ:50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,0.5%TritonX-100(V/V),4 mol/L 脲素。
 
4.  缓冲液Ⅱ:50 mol/L Tris-HCl(pH8.0),2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,3% Triton X-100 。
 
5.  缓冲液Ⅲ:50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,0.5%Triton X-100,2 M 盐酸胍。
 
6.  缓冲液C:8 mol/L 脲素,10 mmol/L β-巯基乙醇,100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2 mmol/L EDTA及脱氧胆酸钠。
 
(二)操作步骤
 
1.  用缓冲液A 漂洗菌体细胞(10 ml/g), 离心6000 g×15 min,收集菌体细胞,重复此步骤,将菌体细胞再在缓冲液A 中洗涤一次。
 
2.  将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中,超声破碎,镜检,破碎率高于95%,离心1500 g×30 min,收集包涵体沉淀。
 
3.  将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次,1500 g 离心收集包涵体沉淀。
 
4.  包涵体的溶解:用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30 min,然后离心1500 g×30 min,留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释,磁力搅拌,透析过夜。
 
5.  溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
 
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