蛋白质组学

BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析法

一、原理
BCR蛋白分析是一种对样品中总蛋白进行量化的分析方法,原理是在碱性溶液中蛋白质可以将Cu2+还原成Cu1+(双缩脲反应),从而出现明显的紫色,铜离子被还原主要是蛋白质分子中半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸,色氨酸四种氨基酸的作用,然而,与Coomassie燃料结合反应不同的是,一般的多肽键都能形成颜色,从而减少了由于蛋白质不同的变异性。

与Bradford分析实验相比较,BCA实验分析更加客观,普通的肽键就能出现颜色反应,其弊端是其反应容易被蛋白质样品中的某些化学物质干扰,包括还原剂(二硫苏糖醇和硫基乙醇等),铜离子螯合剂(EDTA,EGTA)和高浓度缓冲液,但是这些干扰作用可以通过对蛋白质样品的稀释进行消除。

二、材料与试剂

1. 牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)

2. BCA蛋白检测试剂(Pierce)

三、仪器

1. 分光光度计(Tecan)

四、操作步骤

1. 制备BSA标准样。先配制1 ml BSA母液(2 mg/ml,溶于水中),再配制浓度在20-2000 ug/ml 的一系列(5~8)稀释液。

2. 准备BCA工作液(WR)。计算所需工作液的总体积。WR是将BCA试剂A和BCA试剂B按50:1的比例混合(混合液是绿色澄清溶液)。

3. 若在测量管中测定,每个样品需要2.0 ml WR。样品与WR的比例为1:20。

4. 各吸取0.1 ml 标准样和未知蛋白样品,加入标记号的测量管中。设两个一样的空白对照管,一个用于标准曲线,加入0.1 ml H2O来代替BSA。另一个用于蛋白样品,加入0.1 ml 蛋白提取液。

5. 每管中加入2.0 ml WR,充分混匀。

6. 盖上盖子,37℃温浴30 min。

7. 检测前室温放置10分钟。

8. 测量OD562的吸光值。

9. 若在微孔板中测定,需要WR试剂。样品与WR的比例为1:8 or 1:20(当样品有限时)。

10. 各吸取25或10 ul 标准样或蛋白样品,加入微孔中。分别以水或蛋白缓冲液作为标准曲线和蛋白样品的空白对照。

11. 没孔中加入200 μl WR。

12. 盖上盖子,37℃温浴30 min。

13. 检测前室温放置10分钟。

14. 使用酶标仪测量OD562的吸光值。

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