蛋白质组学

TNFα生物学活性检测方法

基本原理

TNF的生物学活性之一是能直接杀伤肿瘤细胞。TNF与相应受体结合后向细胞内移,被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低,各种酶外泄,引起细胞溶解。肿瘤细胞株对TNF-α的敏感性有很大的差异,用放线菌素D、丝裂酶素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞,可明显增强TNF-α杀伤肿瘤细胞活性。

材料和试剂

1,完全培养基(1)10%FCS-DMEM培养液(V/V)。

2,完全培养基(2)3%FCS-DMEM培养液(V/V)0.5-1μg/ml放线菌素-D。

3,0.05%结晶紫溶液:

取50mg结晶紫,用20ml无水乙醇溶解后,加水定容至100ml,室温保存。

4,脱色液:

H2O 50mg

无水乙醇 50ml

乙酸 0.1ml

混匀即可。

5,TNF标准品:由中国药品生物制品检定所提供。

实验操作

1,此实验在无菌环境下进行,实验前超净工作台应用紫外灯照射30分钟以上。

2,用完全培养基(1)将生长状态良好的小鼠L929细胞调至1×105/ml的细胞悬液,100μg/孔加入96孔细胞培养板,5%CO2,37℃培养过夜。

3,标准品稀释:用完全培养基(2)将标准品进行10倍稀释至100IU/ml为起始浓度,再做4倍稀释上板。

4,待检样品稀释:用完全培养基(2)将待检样品进行10倍稀释至一定范围,再做4倍稀释准备上板。

5,弃96孔细胞培养板上清,将标准品及待检样品按100μl/孔加入96孔细胞培养板,同时设对照组和空白组,5%CO2,37℃培养16小时。

6,镜检后,弃上清,每孔加30μl 0.05%结晶紫染色3~5分钟,用流水小心冲去结晶紫,甩干培养孔中的残余水份,加入脱色液100μl/孔,用酶标仪测定570nm的光密度值。

结果计算

1,在座标纸上以OD570比色值(双孔比色值的平均值)对稀释倍数作图,以标准品的最纸、最高平均值作平等于X轴的直线,以各相应样品曲线与该直线的交点,在X轴读出半效量的稀释度。

2,计算公式:

TNF活性(IU/ml)=标准品效价×样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数×标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效稀释度。

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