蛋白质组学

NINTA蛋白提纯的原理、步骤与常遇问题分析

 

Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋白蛋白结合,组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后,带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白流出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。

蛋白过镍柱纯化的原理:Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋白蛋白结合,组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后,带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白流出。Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以也可以与咪唑结合这时候再用咪唑洗脱,梯度洗脱,咪唑竞争性结合到硫酸镍上,目的蛋白就被洗脱了,这时候收集浸出液,那么里面就是你要的目的蛋白,然后透析掉咪唑就行了。现在的柱子大多是预装柱,也就是不用自己填柱,就是装好镍的傻瓜柱,也不贵,上样,洗脱,基本两个步骤就结束了。剩下的看你怎么处理了。

高亲和Ni-NTA纯化介质(L00250)是把螯合剂(氮川三乙酸或NTA)共价偶联到琼脂 糖介质(4%交联)上,然后再螯合Ni2+制备而成。NTA能够通过四个位点牢固的螯合Ni2+从而减少纯化过程中Ni2+泄露到蛋白样品中。Ni-NTA纯化介质可以纯化任何表达系统(原核,酵母,昆虫细胞和哺乳动物细胞等表达系统)表达的天然或变性的His-标签蛋白。结合在介质上的蛋白可以通过低pH缓冲液、咪唑溶液甚至组氨酸溶液洗脱下来。

一、NI-NTA提纯操作步骤

1. 试剂和耗材准备:

Bind Buffer;Wash Buffer;Elution Buffer;柱子;填料;等。

pET.wap.ns②A1; PET21空载体; 200ml诱导表达菌液;

2. 步骤:

2.1 50ml灭菌离心管收集菌液,用冰冷10ml PBS 清洗菌液1次,离心

2.2 重悬8ml bind buffer ,冰上超声破碎,10s间隔,至菌液不在粘稠,分装至EP管,

2.3 4℃ 14000r/min 20min,分离上清,沉淀用5ml Buffer A+DTT重悬

2.5混匀50%NI-NTA,吸2ml 50%NI-NTA ,上柱(做2个柱,1ml NI-NTA/柱),待完全沉淀(约1h),先用10ml灭菌水洗,流速:重力作用

2.6 10ml 1*Bind Buffer 进行平衡,流速:重力作用

2.7 将准备好的样品上样,pET.wap.ns; PET21 only分别上柱(结合时间1h-1.5h流速控制在0.1ml/min左右, EP 管,分管收集上样后液体)

2.8 10ml 1* Bind Buffer 洗柱子(收集洗脱液10管,流速在0.3-0.4ml/min左右)

2.9 10ml 1*Wash Buffer洗柱子(收集洗脱液10管,流速在0.3-0.4ml/min左右)

2.10 5ml 1* Elution Buffer洗柱子(收集洗脱液5管)

2.11 用15ml 0.5m NaoH清洗,时间约0.5-1h(0.5ml/min)

2.12 用20%乙醇清洗,约0.5-1h(0.5ml/min)

2.13 封好加样口,柱子存放4℃备用

洗脱液-80保藏

试剂配方:

10×NI-NTA Bind Buffer (天然条件Binding/Lysis Buffer,100mL)

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O(MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

10mM imidazole 0.68g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH调整PH至8.0,滤膜过滤

10×NI-NTA Wash Buffer (天然条件Wash Buffer,100m L )

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O (MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

20mM imidazole 1.36g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH调整PH至8.0,滤膜过滤

10×NI-NTA Elution Buffer(天然条件Elution Buffer.,100m L)

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O (MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

250mM imidazole 17.0g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH调整PH至8.0,滤膜过滤

1X PBS (0.1M PBS, pH 7.4):

137mM NaCl(MW58.44g/mol) --------------------------------------------- 8g

2.7mMKCl(MW74.55g/mol)----------------------------------------------- 0.2g

10mMNa2HPO4 (anhydrous) (MW141.98g/mol)----------------------- 1.42 g

2mMKH2PO4 (anhydrous) (MW136.09g/mol) ------------------------- 0.27g

Distilled water ----------------------------------------------------------- 1000 ml

Mix to dissolve and adjust pH to 7.4( HCl ,调节)

高压灭菌后,Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.

二、Ni-NTA 常见问题及建议

纯化的组分中没有His 标签的蛋白?

首先确定是蛋白没有挂上柱还是蛋白没有被洗脱下来。若His 标签蛋白没有与柱结合:

可能原因:超声的功率不对( 太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放)

策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶

可能原因:样品或者是结合缓冲液不正确:

策略:检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

可能原因:组氨酸标签暴露不完全

策略:在变性条件下( 用4-8 M 脲,或4-6 M 盐酸胍) 进行纯化。

可能原因:His 标签丢失

策略1:WB 检查His 是否表达,上游构建,改变His-tag 的位置(C- 端或 N- 端),必要时增加His 个数。

策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间。

策略3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。

Ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数6×His 标记的重组蛋白质的首选金属离子。也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。

His 标签蛋白若没有洗脱下来,请依次检查:

可能原因:洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强)

策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。

可能原因:降低pH 的方法洗脱的,因为若pH 低于3.5,会导致镍离子脱落

策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱

可能原因:蛋白已沉淀在柱上

策略:减少上样量,或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度,或在变性条件( 去折叠) 下洗脱( 用4-8 M 脲,或4-6 M 盐酸胍)。

可能原因:非特异性疏水或其他相互反应

策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl 的浓度。

His 标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因? 如何优化?

高纯度的蛋白是纯化工作者的追求,但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS,所以经常会出现HIS 标签蛋白洗脱后有一些杂带,可能的原因和优化的方法如下:

可能原因:蛋白酶部分降解了标签蛋白

策略:请添加蛋白酶抑制剂。

可能原因:杂质对镍离子有更高的亲和性

策略1:咪唑浓度必须优化,以确保高纯度( 宿主细胞蛋白质的低结合) 和高产率( 组氨酸标记的目标蛋白质的强结合) 之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度;在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积),可能分离出有相似结合强度的蛋白

策略2:筛选最适合的缓冲液条件,NaCl 浓度,pH 的范围都需要进行筛选。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时,将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成不同的混合配方来进行优化。

策略3:若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白,需要考虑多步纯化的思路,如利用Strep 标签进行两步纯化或采用Subtractive method 进行纯化。

可能原因:杂质和标签蛋白结合在一起

策略:在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20);或者在Wash buffer 中增加甘油的浓度(50%) 减少非特异性的相互反应;考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。

可能原因:洗涤不充分

策略:增加洗涤的次数,使洗涤充分。

蛋白过镍柱纯化步骤中,因为现在很多都是预装柱,也就不用自己装填料了,一般的蛋白纯化 也就只有上样和洗脱两个步骤了。需要注意的是纯化过程中流速不应该过快。

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