蛋白质组学

脂肪氧化酶活性测定

各位同学,本人前些日子做了脂肪氧化酶活性测定的工作,遇到了一些问题,想在这里向大家请教,希望大家能不吝赐教,来帮助我解脱心中的迷惑。

本人是做植物材料的,从叶片中提取粗蛋白,0.5g叶片使用液氮研磨,加入到4ml冰预冷提取缓冲液(0.05mol/L PH6.4 磷酸钠缓冲液,1mmol/L EDTA,1%PVP,1mmol/LDTT)中,12,000g,4℃离心10min,取上清进行脂肪氧化酶酶活性分析。

通过检测234nm光吸收(Beckman DU800, Beckman)来测定脂肪氧化酶活性,底物溶液配制:280mg亚油酸,280mgTween-20加入到8mL双蒸水中,上下颠倒混匀,加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加双蒸水定容到50mL,-70℃保存备用(Huang, et al. 2005)。

2mL反应体系包括:1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸钠缓冲液,50μL底物溶液,20μL酶粗提液,同时设立不加酶的空白对照,25℃反应3min,记录234nm光吸收变化。

实验方法就是上面所说的,但是遇到了几个问题。

1.在不加入粗蛋白的情况下,234nm光吸收持续上升,我觉得可能是亚油酸在空气中氧化造成的,我又无力避免。

2.采用不同PH的缓冲液,不加粗蛋白的情况下,234nm光吸收上升的速率不同,PH越高234nm光吸收上升速率就越缓慢。

3.在加入粗蛋白后,234nm光吸收不升反降,在3分钟后才又上升。

这样一来我测酶活反应基本不可能,我觉得可能是我测酶活的反应体系出了问题,在测原核表达后的酶活性该体系还马马虎虎,在PH6.4时的确还是转化的大肠杆菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些,但是从叶片中提取的粗蛋白就不能测出来酶活性了。

在后续的实验我还想做酶反应后的产物的HPLC分析,如此强的本底反应让我不知道还要不要做下去,我的方法是克隆一篇文献的方法,这里我不是怀疑人家工作的真实性,我想可能还是我愚钝。

[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797

各位兄台,給我出出主意吧,基因克隆出来,原核表达也还不错,整个实验卡在最后,虽然原核表达后有一些酶活性,但是总是觉得反应体系不是很好,试验不是很稳定,想进一步做些酶学分析,这样的体系真是不可靠。

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