蛋白质组学

凯氏定氮法测定蛋白质的含量

 

一、原理:有机含氮化合物与浓硫酸共热消化,氮转化为氨,再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应,放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中,再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量,计算样品的总氮量。

二、试剂与材料:

浓硫酸、硫酸钾-硫酸铜粉末(称取80g硫酸钾和20g硫酸铜(五水),0.3g二氧化硒研细混合)、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂(田氏指示剂)储存液(取50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红溶液混合,储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色;PH为5.4为暗灰色或灰色;PH5.6为绿色;变色点为PH5.4)、硼酸-田氏指示剂混合液(100ml2%硼酸溶液,滴加约1ml田氏指示剂,摇匀后,溶液呈紫红色)、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉

三、操作方法

1、样品处理:固体样品,应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量,也可经适当稀释后,吸取一定量进行测定,使每一样品的含氮量在0.2-1.0mg范围内。

2、消化:取一定量样品,于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾-硫酸铜混合粉末,再加入3ml浓硫酸。用电炉加热,在通风厨中消化,瓶口加一小漏斗。先以文火加热,避免泡沫飞溅,不能让泡沫上升到瓶颈,待泡沫停止发生后,加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全,直至消化液清澈透明。

另取凯氏瓶一个,不加样品,其它操作相同,作为空白试验,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质,以对样品进行校正。

3、蒸馏:将微量凯氏蒸馏装置洗涤(先用水蒸气洗涤)干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后,全部转入100ml的容量瓶,用蒸馏水定容至刻度。

吸取20ml稀释消化液,置于蒸馏装置的反应室中,加入10ml30%氢氧化钠溶液,将玻璃塞塞紧,于漏斗中加一些蒸馏水,作为水封。

取一三角瓶,加入10ml硼酸-田氏指示剂混合液,置于冷凝管之下口,冷凝管口应浸没在硼酸液面之下,以保证氨的吸收。

加热水蒸汽发生器,沸腾后,夹紧夹子,凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸-指示剂混合液,吸收蒸馏出的氨,由紫红色变为绿色。蒸馏15min,让硼酸液面离开冷凝管口,再蒸1-2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

4、滴定:样品和空白均蒸馏完毕后,用0.01M标准盐酸滴定,至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色,即为滴定终点。

四、计算 样品总氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20

式中:A:样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B:空白滴定时消耗的盐酸体积 C:标准盐酸的当量浓度 14:氮的相对分子 量 20:用于蒸馏的稀释消化液体积 100:稀释消化液的体积

样品中粗蛋白含量(mg)=样品总氮量(mg)×6.25

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