蛋白质组学

酵母单杂交实验中cDNA文库构建试剂盒的选择及操作步骤

酵母单杂交 法是研究特定DNA序列和蛋白质相互作用的有效手段,cDNA文库构建作为酵母单杂交实验的核心技术,那么酵母单杂交实验中cDNA文库选择什么试剂盒构建呢?

酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA -蛋白质间的相互作用。

酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质 ,可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。

酵母单杂交原理: 将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter,Pmin)上游,把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain,AD)融合表达载体导入细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件结合,而激活Pmin启动子使报告基因表达。

酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因,验证反式转录调控因子的DNA结合结构域,准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。

酵母单杂交用的cDNA文库用什么试剂盒构建?

单杂交文库可以用酵母双杂交试剂盒中的SMART试剂盒来构建

用BD公司的酵母单杂交文库构建和筛选试剂盒进行酵母单杂交文库的构建。具体操作步骤为:在15 mL试管中依次加入如下成分:20 μL SMART cDNA、6 μL pGADT7-Rec2(0.5 μg/μL,SmaI-线性化)、5 μ

g pHIS2-PBE1钓饵载体、20 μL Herring Testes Carrier DNA(用前于100 ℃变性5 min,然后迅速置于冰上)、600 μL 酵母Y187感受态细胞,轻轻混匀,再加入2.5 mL PEG/LiAc (40% PEG 3350,1×TE Buffer,0.1 mol/L LiAc),轻轻混匀。

30℃温育45 min,每隔15 min混合细胞1次,然后加入160 μL DMSO,混匀后置42℃热冲击20 min,每隔10 min混合细胞1次,反应结束后700 g 离心5 min,去掉上清,用3 mL YPD Plus Liquid Medium(BD公司)重新悬浮细胞,于30℃,265 rpm振荡培养90 min,700 g 离心5 min,去掉上清,用6 mL NaCl (0.9%)重新悬浮细胞。

为计算转化效率,取100 μL分别稀释10倍、100倍、1,000倍的转化液涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp平板上,剩余样品涂布于SD/-His/-Leu/-Trp(含适当浓度的3-AT)平板筛选阳性克隆,30℃培养3 d-7 d。

同时转化pGADT7-Rec2-53和p53HIS2作为阳性对照以及pGADT7-Rec2-53和pHIS2作为阴性对照。

小结:酵母单杂交实验中cDNA文库筛,选择重组质粒的阳性克隆是关键点,实验室最常听说的就是BD 公司的Clontech。

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