蛋白质组学

关于bsa标准曲线的制作方法讨论

它们都是BSA

1、选择应用考马斯亮蓝方法测蛋白质量,做BSA 标准曲线步骤时已经测得梯度蛋白量的吸光值。想求助:在excel中怎样做标准曲线。

Q1、很简单的,将蛋白质浓度放在一列,相应的吸光度放在一列,将两列选中后,选择插入图形,选散点图,然后在插入的图形上的点右击选择添加趋势线,并勾选显示公式和R值,即可得到方程式。

Q2、用梯度蛋白量和吸光值先做出散点图,然后点击选中直线,在直线处点击鼠标左键,出现“添加趋势线”,点击进入,在“类型”菜单中选择“线性”,在“选项”菜单中选择“显示公式”“显示R2值”,点击“确定”,图中即出现线性方程和R2,此方程即为标准曲线方程。

2、如何测BSA的标准曲线?配置BSA 标准溶液时,需要精确浓度到小数点后四位吗?

一般3个9以上就可以了,我们实验室一般认为99.98%就足够。

可以的,要注意几点,一个是配置高浓度原液,而后在其基础上稀释;二是充分震荡,每个步骤都要充分震荡;三要选择比较好的蛋白测定试剂盒,能用进口的就不要用国产的!

3、为什么BSA可以用来做标准曲线而不是选其他蛋白?

Q1、分子 量68KD。BSA用的多主要是便宜,其他一些纯蛋白是非常贵的,差价几万倍都是可能的。

4、BSA是否每次做标准曲线都要重配?

Q1、不用,你可以一批配100ml,然后分装成小管冻存起来,以后每次用的时候取一只,这样可以避免多次配置所产生的差异,使用也方便

Q2、书上写一般情况下都是要做标曲的,但是不做的话差别也不是太大,但是要精确的话还是得做标曲.

5、我用考马斯亮蓝染色的方法作BSA标准曲线,怎么也做不出来!4mg/ml,5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml,10mg/ml的 bsa在595nm下的吸光值没有明显的区别,还出现浓度越大,吸光值越小的现象,真是令我哭笑不得,请高手指点,谢谢!

Q1、1,看看你的考马斯亮蓝是否配的有问题,注意配好后必须用慢速滤纸过滤,保证滤液中没有蓝色沉淀(会影响OD595)。

2,你的BSA浓度太高了,测定是OD595会很大。在测定光吸收时,测量值的准确度数范围是:0.1-0.3。读数大于0.5时就不准了。

3,BSA要现用现配,不可久放。

以下测量方法仅供参考:

取21支试管做三组平行(每组7支):

向7支试管中依次加入:

(1)考马斯亮蓝 各5ml;

(2)分别加入0.15mol的NaCl 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04ml;

(3)分别加入1.0mg/ml的新配的BSA 0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06ml;

混匀后,在595nm处测光吸收,读数大部分在0.1-0.3之间。

注意最好在加入BSA 5-20min内测完,此时间内颜色最稳定。

然后三组求平均,用蛋白含量对OD595作图,线性拟合后,一般得到直线的R>0.99,严格要求应使R>0.999.

在测量蛋白浓度时,可先将其稀释为0.5-2mg/ml 左右,加入0.02-0.08ml;即可得到一个较好的读数(一般在0.1-0.3之间)。

Q2、你的标准曲线范围有问题,BSA浓度从0.1~1mg范围内选择,那样的浓度都是超出量程的,测了也没用.还有,机器的量程是多少你没说,吸光值在0.1~1范围内还是比较准确的,这还是进口设备,国产的量程有效范围更窄.自己重新设计实验吧

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