蛋白质组学

影响蛋白超滤的因素以及使用超滤膜的注意事项

超滤主要采用多孔材料,在压力驱动下将物质进行膜分离的过程,这种多孔材料成为超滤膜,那么影响蛋白超滤实验的主要因素有哪些呢?使用超滤膜处理蛋白有哪些注意事项呢?

蛋白超滤实验的影响因素

蛋白超滤实验中,主要会受到哪些因素的影响?超滤透过通量的影响因素如下:

1. 料液流速

提高料液流速虽然对减轻浓差极化、提高透过通量有利,但需要提高料液压力,增加耗能。一般紊流体系中流速控制在1-3m/s。

2. 操作压力

超滤膜透过通量与操作压力的关系取决于膜和凝胶层的性质。超滤过程为凝胶化模型,膜透过通量与压力无关,这时的通量成为临界透过通量。实际操作压力应在极限通量附近进行,此时的操作压力约为0.5-0.6Mpa。

超滤过程中只有当工作压力达到一定程度,才能使液料中的小分子 透膜分离。工作压力太小时,滤液的产量小,不能满足正常的生产。而工作压力太大时,会增加极化层的厚度,抵消增压的增速效果,同时也会把沉积在膜上的沉积层压实,难以被冲刷,膜孔很快被堵塞,影响超滤效果,此外,每一种超滤膜均有其耐压范围,使用时应在这个范围内进行。

3. 温度

操作温度主要取决于所处理的物料的化学、物理性质。由于高温可降低料液的黏度,增加传质效率,提高透过通量,因此应在允许的最高温度下操作。

温度升高时可部分克服分子 间的作用力,降低粘度。同时也影响膜的工作性能,增加通透性。温度过高也会影响超滤膜的寿命。

4. 运行周期

随着超滤过程的进行,在膜表面逐渐形成凝胶层,使透过通量下降,当通量达到某一最低数值时,就需要进行冲洗,这段时间成为运行周期。运行周期的变化与清洗情况有关。

5. 进料浓度

随着超滤过程的进行。主题液流的浓度逐渐增加。此时黏度变大,使凝胶层厚度增加,从而影响透过通量。因此对主体液流应定出最高允许浓度。

料液浓度直接影响滤速。超滤的通量与浓度的对数呈直线关系。一般来讲,随着料液浓度的增高,料液的粘度会升高,超滤时形成极化层的时间会缩短,从而使超滤的速度降低、效率也降低。因此在超滤时应注意控制料液的浓度,

6. 料液的预处理

为了提高膜的透过通量,保证超滤膜的正常稳定运行,根据需要应对料液 进行预处理。 预处理效果好坏,直接影响超滤膜的污染程度,系统的生产能力以及超滤膜的使用寿命。预处理一般采用高速离心法、微滤法、调PH值、热处理、冷藏法或多种方法组合进行。近年来发展起来的絮凝剂法可去除提取液中的鞣质、色素、果胶等有机大分子不稳定物质。

7. 膜的清洗

膜必须进行定期冲洗,以保持一定的透过量,并能延长膜的使寿命。一般在规定的料液和压力下,在允许的pH值范围内,温度不超过60。C时,超滤膜可使用12-18个月。如膜清洗不佳,回使膜的寿命缩短。

8. 超滤膜孔径大小

超滤膜孔径大小的选择应与药液中目标成分的大小相一致。孔径过大,则分离效果不好,杂质含量过高,影响澄明度和稳定性。孔径过小,有效成分通透率较低,损失较大。

9. 洗脱量

蛋白超滤膜的使用问题

洗脱量的多少影响滤液中目标成分的含量。洗脱量太少,则留在浓缩液中的目标成分会较多,损失较大;洗脱量太大时,虽然回收率增加,但有可能需要后处理或使原有的后处理工序时间延长,应注意协调它们之间的关系。

(一)问题:超滤膜处理蛋白时,使用前应该做哪些处理呢?

1. 使用后应将超滤膜用0.2MNaOH处理30分钟,然后用水清洗之中性,最后保存在20%的乙醇中。

2. 根据使用的超滤膜的性质(稳定性),一般情况建议用0.1~0.5M NAOH,进行30分钟以上的清洗,在使用前后通过测试膜的水通量评估膜的透过性能和清洗效果。为了减少蛋白的损失,建议浓缩前用缓冲液润洗膜,浓缩后用缓冲液冲洗膜回收蛋白。并且保存膜的条件也要根据膜性质选择合适的条件。

(二)问题:虽然知道是一次性的,但实验室的Millipore 超滤还是久经考验,用了又用。但最近超滤一个悬浊液,不慎把膜堵了,请教高手有没有在不损伤膜的前提下把堵膜的物质洗下来。(改物质可能是一些蛋白沉淀)

呵呵 不要仅仅建议我重新买噢!我需要建设性意见,先谢谢了!

1. 如果堵得比较厉害,还可以在NaOH溶液中加点NaClO效果会更好,洗膜的时候最好用热的溶液。

2. 我用一个管子提一种蛋白的不同溶液,纯化后的分部收集管子.如果保养的好可以用很多次.一般不用时候放在乙醇中,放置染菌. 另外,容易出问题的环节主要有 滤膜破裂,套管破裂,滤膜堵塞等.我最近碰到的问题就是堵塞.楼上的方法不错,今天试用过了.另外,需要提醒你的是:滤膜过滤后,附着在膜上的蛋白量比较大,也就是说,体积的变化倍数和浓缩倍数是不一样的

3. 可以使用 0.1-0.5 M NAOH清洗

(三)问题:在使用之后,用水和1N NAOH 清洗完后,测得水通量也没问题。但是在把膜包从夹具拿出来准备 保存的时候 ,发现膜包边上的 小孔仍然有很多 可见杂质。

这些杂质是否需要用物理方法处理掉?

建议在你的样品上超滤前选用0.45um的膜过滤一下,这样就不会有这个问题了,长时间有大颗粒或别的杂质进去对膜包可不太好。

(四)问题:我的蛋白14kD,用截流10000的怎么一点都离不下。而且在我只加超纯水时,水也离不下,十分迷惑

你是用超滤离心管吗?水都离心不下,不是离心力不够吧,要不膜用别的什么处理过了变疏水的了。还是选错了型号。

(五)问题:请问millipore的超滤管可以反复使用吗? 如果可以的话,第一次使用后该如何处理呢?

为避免交叉污染,同种蛋白我想可以重复使用。

millipore的膜,您选择的是什么材质。

如果是PES材质,那么用后可以用0.5M NaOH浸泡,这样水通量可能会保持的久一点。

(六)问题:目前我公司也在用millpore得超滤系统以及超滤管,也存在一些问题想咨询一下。超滤管在使用过以后应该如何维护才能延长使用寿命保证超滤效果?

超滤管一般是一次性使用的,有些时候可以反复用几次,就当白赚了。

一定要谈维护的话,在材质允许的情况下,如PES的膜,用毕可以用0.1-0.5M NaOH浸泡,有可能多用几次。

具体millipore的材质,需要和millipore咨询

(七)问题:请问如何选定超滤膜的孔径大小?如果我选择30kd得超滤管,那么我得到的目标蛋白应该在什么范围之内?

那很难说,不同公司的膜孔径标称是存在明显差异的,没有通用标准。

而且,某个蛋白的具体的截留状况和蛋白的浓度、构象、buffer种类、压力、膜材质、是否滤洗等密切相关。

只能说,如果希望100%截留某个蛋白,一般膜孔径选择为目标蛋白的1/3-1/5。

(八)问题:用10KD,15ml的超滤管超滤含20KD目的蛋白的蛋白溶液,会不会有目的蛋白穿过滤膜呢,我同学用这个超滤管超滤17KD的蛋白液,竟然有目的蛋白透过滤膜

可能会有一定的透过损失,因为截留和分子的形状也有关系。

为了100%截留, 超滤膜的截留分子量最好是目的蛋白的1/3比较保险

(九)问题:我们公司需要的是通过超滤管的那部分液体,将我们的产品分离,我说的超滤液就是指离心以后,透过滤膜进入一次性试管中的那部分液体,而不是残留在超滤管中的那部分液体。我们的目标液体就是离心出来的那部分液体,我想知道的是,30kd的滤膜截留的应该是30000以上的蛋白质分子吧,30000一下的蛋白分子是不是就随着离心作用流入试管中了?

滤膜的孔径并不像你想象的那样是完全均一的,事实上,膜的孔径是一个范围。膜分离的分辨率并不像你想象的那么高。只有分子量相差10倍以上的两种分子,才有可能使用膜分离技术加以分离。

膜孔径的选择,

如果希望截留目标物,膜孔径一般是目标分子量的1/3-1/5;

如果希望目标物透过,膜孔径需要是目标分子量的5-10倍。

所以剩下的,你就可以自己判断了。

用30k的膜多数情况下不能完全截留30k的分子,一定有一部分会透过膜,但也常常会有一部分被截留。

(十)问题:狠狠心买了一个包装的millipore超滤离心管,用了一支没结果,问问清楚:

1。用于同一种样品的浓缩,可以重复使用该离心管吗?——我用一支管子(15ml)分次离心了60ml的样品,浓缩到250ul;

2.实验室的吊桶式离心机达不到说明书上的4000g,最多3000rpm,通过延长离心时间来达到浓缩倍数可以吗?

(十一)使用应注意什么才能高效而蛋白损失最小?

1. 应该可以,因为超滤管的作用只是像个筛子一样,把分子量小的蛋白漏下去,分子量大的留在上面,既然是筛同样的东西,应该可以用同一把筛子吧——土人小时候在家里干活用筛子筛过谷子、豆子什么的,所以这一点还是知道

2.可以的,只是慢一些,多等一会而就是了。

3.我也只用过几次超滤管,所以也不知道这里面有些什么学问——用筛子筛谷子好像也没有什么学问吧 2.相同的centricon可以反复多次使用,只要把sample container 掉过来离一下除去上次的成分即可,也可用1N的NaOH处理一下滤膜以除去残留的蛋白。

其中离心管再次使用的最关键的一点是 在一次使用后完,除去残留物后,用70%乙醇滴加在膜上,防止干膜和长菌。由于乙醇易挥发所以要经常看一下,千万不要干膜(那样纤维会裂,不能起到有效分离作用)。

3.我的经验是:应根据你浓缩的样品来确定超滤离心管的清洗再生方法,比如有些残留蛋白不能用高浓度NaOH去除,因为高浓度NaOH使其立即变性,结合在膜上非常紧,反而难以清除,同时对膜的使用寿命也有很大影响。清洗再生的方法很多,但不宜采用较剧烈的方式。

平常保存可以将离心管浸泡在20%的乙醇里,抑菌保存,一般每周更换一次乙醇。

4. 可以反复用,但反复用后滤过流量下降,需要延长滤过时间,我用50%甘油防止膜干燥

蛋白质层析技术与超滤技术是蛋白质分离常用技术方法:主要包括 吸附柱层析、 薄层层析、聚酰胺薄膜层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、聚焦层析。超滤技术由于其典型的高通量,实验 操作条件比较温和以及容易于大规模操作等特点,已经广泛使用。

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