蛋白质组学

蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析

蛋白纯化技术专题

蛋白纯化 试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等,本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。

蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化 试剂盒用途有什么不同?

蛋白抽提试剂盒是从细菌 、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、带化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。

蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签 GST HIS 标签的重组 蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni-Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质,可以用于纯化抗体。抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合,在低盐低pH值条件下解离。蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

GST常见问题 解答集锦纯化方法的问题解决

以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有 提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.

问题 可能原因 解决方法 G S T 标 签 蛋 白 GST标签蛋白被机械裂解的方法 在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件.裂解的条件 不结合柱子或 变性(比如超声).过分的裂解 必须依照经验来决定. 结合非常弱 会使标签蛋白变性,阻止其结 合. GST标签蛋白在样品中有聚集, 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀 标签蛋白的浓度过低 的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能 不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样 品会提高结合. 标 签 蛋 白 可 能 改 变 了 G S T 的 构 检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的 象,因此降低了GST标签蛋白的 pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合 结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了 GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4°C限 制洗涤来改善结果. 平衡时间太短 确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过 (比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高 在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如 于8时结合效率低 GSTrap柱:柱子需要清洗 PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱 已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用 使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录 次数过多 样品上样过程中的流速过高 2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参 数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上 样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或 柱:柱子或系统被堵住了,导致 用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于 0.3MPa,根据手册清洗系统 在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合 检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被 调节到适合结合缓冲液的条件.

1G S T 标 签 蛋 白 洗脱缓冲液的体积不够 不能被高效的 洗脱 洗脱的时间不够

增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有 标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用 0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流 速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离 心速度.

谷胱甘肽的浓度不够

增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试 使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作 为洗脱缓冲液.

洗脱缓冲液的pH过低

增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不 用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.

洗脱缓冲液的离子强度过低.

增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.

洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化 使用新鲜的洗脱缓冲液. 了 加入DTT.

非特异的疏水相互作用导致蛋白 向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从 或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的 而 阻 止 了 标 签 蛋 白 的 溶 解 和 洗 洗脱. 脱. 电泳或蛋白质 分子量为70 000 的蛋白与GST标 分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测 签蛋白共纯化 发现多条条带 该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作 用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏.或者把有标签 蛋白通过ATP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层 析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解 加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白 酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会 使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸 蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.

2在宿主细菌中的蛋白降解

用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋 白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型 菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.

在机械裂解过程中细胞破碎

降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可 以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白 变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯 化.

分子伴侣可能被共纯化了

包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分 子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋 白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共 纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.

抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白 抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应 它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠 杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来 除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已 经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白 质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切 蛋白酶切发生在宿主细菌内 后电泳检测发 现多条条带 检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可 能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子 Xa的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统 手册》.

His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略

HisTag 蛋白纯化篇:用基因工程的方法来表达蛋白质,必须经过纯化才 能实现最终目的。相比核酸纯化来说,不同的蛋白质特性千差万别,纯化条件很难摸索,想 找一种通用的纯化方法一直是个难题。 将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达, 通 过亲和纯化 Tag 蛋白来纯化目的蛋白,是我们常用的间接手段。 用于融合表达的亲和纯化蛋白标签,首先个子越小越好,这样不会对目标蛋白的构象、大小 和特性产生显著影响,方便直接对融合蛋白进行下游操作;以前常用的融合表达亲和标签 GST(谷胱甘肽转移酶)个子就比较大,在纯化后需要先切除标签后才能进行下一步的检测分 析。其二生理条件下带电越少越好:需要借助融合表达纯化的许多蛋白通常在生理溶液 pH 下进行分析研究或者复性,融合标签带电少,对蛋白质的表达、分泌、折叠、构象形成等影 响小,比较容易得到和天然蛋白相似的产物。第三融合标签的免疫原性越少越好,融合产物 不必除去标签可直接作为抗原免疫 横看竖看,6xHis Tag 都是比较理想的,6 个组氨酸个子小,pH8 是不带电,免疫原性差, 利用优质的带镍离子的纯化填料进行亲和纯化,目标蛋白纯度高,方法简单方便,成本低, 已得到国内外研究人员的广泛应用。想当年刚进实验室时,表达 6xHis 的 HisTag 还算“前 卫”技术(表达纯化一个带有 HisTag 的“有重要意义和光辉前景的”蛋白就可以混个硕士 毕业),如今早成主流了。 我们技术专题早前的表达系统专题中已经介绍过多种带有 His-Tag 的表达载体, 表达 之后自然需要考虑如何纯化,市面上纯化 HisTag 的产品多种多样,应该如何选择呢?目前 市面上主流产品都是利用 His.Tag 序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯 化。 金属镍离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上, 当融合蛋白溶液流经亲和纯 化介质时,融合蛋白被特异亲和吸附,杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白。最常用的螯合物包括 氮川乙酸(NTA)和亚氨二乙酸(IDA),它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位 点。在这里介绍几个市面口碑较好的产品和方法,包括常见的 HisTag 纯化高端品牌: Qiagen,GE,Novagen 等。 Qiagen 产品的 2 大特点是 4 价螯合的 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid);以及种 类齐全。Qiagen 专利的 4 价螯合的 Ni-NTA 纯化填料,由于镍离子通过 4 价键螯合在纯化树 脂(填料)上,比 3 价的 Ni-IDA 要稳固且不容易脱落,且 NTA 与还原二硫键的 beta- 巯基乙 醇相容;而存在其它螯合或还原成分时, IDA 树脂的金属镍离子容易脱落可导致纯化结果 不甚理想。因此 Ni-NTA 实际应用中的蛋白纯化效率和得率较高。因于这种稳固性,Qiagen 的 Ni-NTA 纯化介质不单可用于纯化带 HisTag 的表达产物, 还可以作为固定介质用于研究蛋 白质间的相互作用或者蛋白质和核酸间的相互作用、 研究蛋白质受体和配基的相互作用、 甚至用于纯化与融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。

Qiagen 的 Ni-NTA 纯化介质产品种类最为齐全,设计非常细心体贴,不过花太多,就容易眼 花缭乱,我们说花多眼乱。Qiagen 的目录里是根据纯化实验的规模分为大、中、小规模, 具体又分为高通量和手工纯化等区别, 对于急着寻找自己需要产品的人来说自然便捷; 不过 作为的技术专题文章, 我个人来说更愿意按照介质种类的不同来介绍, 因为理解了材 料的区别,一切都清晰明了,就能更深入了解不同品牌、不同类型、不同产品的特色。 Qiagen 的 Ni-NTA 系列产品可分为 4 类:Ni-NTA 琼脂糖、Ni-NTA Superflow、Ni-NTA 磁珠、 Ni-NTA 离心柱(Spin Column)。 昔年做销售时 Ni-NTA 琼脂糖是最多人买,因为价格相对便宜,质需要将澄清的裂解液(或 者离心或者过滤)直接上柱,洗脱,就可以一步纯化出带有 His Tag 的融合蛋白。这个目标 蛋白载量 10mg/ml 左右,介质是 Sepharose CL-6B,最大流速是每分钟 1 毫升,可耐受的最 大柱内压 2.8psi(0.2bar),适合自己装重力流常压液相层析柱,可以根据每次实验目标蛋 白的含量来调整纯化填料的使用量和装柱的长度,比较灵活避免浪费。不过但凡客户问到, 我都愿意推荐 Ni-NTA Superflow。Ni-NTA Superflow 介质是高度交联的琼脂糖凝胶,同样 只需一步就从澄清的细菌裂解物中纯化得到带有 HisTag 的融合蛋白,可以耐受天然或者变 性条件,包括 8M 尿素,或者 6M 盐酸胍,还可以耐受 20mM 的巯基乙醇或者 10mM 的 DTT 等还 原剂。除此之外,Ni-NTA Superflow 可以耐受更高的压力(140psi,10bar),流速更快(最 大可达到 20ml/min),可以上快速蛋白液相色谱(FPLC),载量达到 20mg/ml。我们都知道 做蛋白纯化是非常考耐性的工作, 如果是自己装稍微长些的重力流柱, 整个纯化过程无比漫 长。流出的速度过快不单影响结果,还会损害纯化柱子。选择速度、耐性和强度都更加出色 的 Ni-NTA Superflow 自然更好些。两种填料都可以耐受很宽的 pH 范围(pH3-12),如果处 理时间在 2 小时内,都可以耐受 pH2-14 而保持稳定。 纯化填料虽然在使用上比较灵活节约, 可以根据实验中目标蛋白的大概含量来调整装柱的填 料多少,不过装柱始终是个麻烦事,速度慢不说,有气泡、有裂缝、干柱等等意外就会前功 尽弃, 每次装柱的差异都有可能影响结果的重复性。 散装填料更适合那些专门做纯化或者蛋 白纯化经验非常丰富的高手。Qiagen 很快意识到,对于多数实验人员来说,更重要的是利 用先进的实验工具或者方法快速得到实验结果,而不是反复练习实验技能。于是,Ni-NTA Superflow 预装柱上市了。这种预装 1ml 或者 5ml 的柱子保留了填料的大部分优点,省掉了 自装柱子的麻烦, 最重要的是令实验能得到更好的重复性。 预装柱既可以适配于多种型号的 快速蛋白液相色谱仪或者蛋白纯化工作站, 也可以利用注射器进行手工操作。 优化的 Ni-NTA Superflow 预装柱的再生非常方便, 仅需要用 NaOH 流过处理 30 分钟即可再生使用。 离子 Ni 结合相当牢固,就算多次再生后,偶然发现纯化效果下降需要用镍离子重新螯合填料,其操 作也相当简便。 除了 Ni-NTA 琼脂糖、 Ni-NTA Superflow, 另外一个好用的是 Ni-NTA 离心柱 (Spin Column) 。 这个 Ni-NTA 离心柱(Spin Column)和核酸纯化的小离心柱很象,不用慢慢等它一滴一滴 流, 也不要特殊的豪华仪器, 只要离心机就够了, 真的非常方便。 每个柱子载量是 150 微克,

特别适合研究的初期阶段时小量纯化做快速的检测分析。 毕竟, 要做到摸条件大规模纯化蛋 白的,还远着呢,花那工夫不如早点出结果哦。 至于 Ni-NTA 磁珠,那是为高通量快速纯化多个微量样品的机器而准备的,因为纯化过程中 需要吸附、洗涤、洗脱等多个步骤,利用磁珠在磁场中的悬浮就可以很方便的进行这些步骤 而避免抽滤,减少抽滤对蛋白产物的影响。Ni-NTA 磁珠最好配合 Qiagen 的纯化工作站,对 于是手工操作就没有多少意义。

蛋白纯化试剂盒需要有目标蛋白有亲和纯化标签,例如:HIS(组氨酸标记)、GST(glutathione Stransferase ),利用亲和纯化介质与蛋白间的相互作用,达到了分离纯化蛋白的目的。蛋白纯化试剂盒产品推荐:GST标签纯化试剂盒(高通量) 、组氨酸标记纯化试剂盒(高通量) 、组氨酸标记纯化试剂盒 、磷酸肽纯化试剂盒 、链霉素标签亲和纯化试剂盒 、T7 标签纯化试剂盒 、自动蛋白质纯化试剂盒(磁珠) 、免疫球蛋白G纯化试剂盒(蛋白A) 、免疫球蛋白G纯化试剂盒(蛋白G) 、其他抗体纯化试剂盒 。

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