蛋白质组学

酶的分离纯化方法介绍

 

生物细胞产生的酶有两类:一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶,称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶,如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶,就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高,容易得到;另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催化作用,称为细胞内酶,如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应,就是在多种酶催化下在细胞内进行的,在类酶在细胞内往往与细胞结构结合,有一定的分布区域,催化的反应具有一定的顺序性,使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的,但每一种酶的含量却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多,但各种酶的含量却差别很大。
因此,在提取某一种酶时,首先应当根据需要,选择含此酶最丰富的材料,如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物 果实中提取酶制剂受到原料的限制,如不能综合利用,成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多,既不受气候地理条件限制,而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到,微生物繁殖快,产酶量又丰富,还可以通过选育菌种来提高产量,用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中,除了我们所需要的某一种酶之外,往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质,因此为制取某酶制剂时,必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质,蛋白质很容易变性,所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱,保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标,在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤,始终要测定酶的总活力和比活力,这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶,纯度提高了多少,从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤:即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液,此时不可避免地夹带着一些杂质,然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来,或者从此溶液中选择性地除去杂质,然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍:

一、预处理及固液分离技术
1.细胞破碎(Cell disruption)
高压均质器法:此法可用于破碎酵母菌 、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中,菌体从高压环境转到低压环境,细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率,起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力,减少操作次数。但有人报道,当操作压力达到175Mpa时,破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时,细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门,尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法:蛋清中含有丰富的溶菌酶,价格便宜,常用来裂解细胞。具体做法是:溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg,置于0.5%的氯化钠溶液中,使细胞浓度为5%(干重),在35℃用0.68kg(干重)的蛋清处理20min,得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理,用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去,再将乙醇浓度提高到75%(体积分数),可以得到纯度为5%的过氧化氢酶 1500g。
2.离心
离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型,所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔,壁上有过滤介质,一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离,如发酵液中的菌体,用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统,除了应具备离心机的一般要求外,还应满足生物生产的技术要求,这包括灭菌、冷却、密封,以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤,并进行程序控制:离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置,具有双重轴向密封,密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成,密封由水连续冷却和润滑,可防止产品被污染,也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器,可在121℃温度下进行蒸汽灭菌,该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套,对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却,并能有效地控制温度,这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离,可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善,如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。

3.膜分离技术
在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜,使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜,而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径,而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是:操作条件温和,无相变化,对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成,料液经泵打入超滤器,水及低分子量物质排出超滤器外,被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题:第一,在超滤循环过程中,由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用,料液的温度会逐渐升高,会造成蛋白质分子的损失。因此,料液贮罐应加冷却系统,并安装自动测温及控制系统。第二,某些酶的辅助因子散失为问题:一些酶含有辅助因子,其分子量小,超滤时易从透过液中排除掉,因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是:当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时,如果在膜的一侧结合着亲和配基,该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来,洗脱液用于进一步的分离纯化。

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