蛋白质组学

各种各样的蛋白标签 从容应对蛋白实验

我们知道,不少蛋白实验都离不开抗体。但是,即使抗体公司时不时推出新产品,许多蛋白还是没有相应的抗体,很多情况下我们只能望产品叹气的份了。而且,我们还要面对很多抗体无能为力的情况,比如观察蛋白在细胞内的运输。不过,有了各种各样的蛋白标签,您面对实验问题会从容不少哦。

遗传标签

蛋白标签大体可分为三大类:遗传标签、in vivo标签和in vitro标签。大家最熟悉的莫过于遗传标签,即c-Myc、FLAG等。我们将目的基因对框克隆到含有标签的载体 上,以便下游通过抗体或荧光检测。同时,标签的存在也方便了蛋白纯化。

Sigma-Aldrich和安捷伦(原Stratagene)都提供带有FLAG、c-Myc或CBP(钙调蛋白结合肽段)的载体 系统。此外,它们还提供编码“串联亲和标签”的载体,即利用两个肽段序列进行两步法纯化,以产生高纯蛋白。

例如,Sigma-Aldrich的TAP系统将FLAG和HA(血凝素)标签与目的蛋白偶联,先通过FLAG抗体柱分离蛋白,再通过HA抗体柱纯化,可获得比一步法更纯的蛋白。这种策略常用于捕获完整的蛋白复合物和评估蛋白之间的相互作用。

荧光蛋白 标签

若是与荧光蛋白融合,则能够实现目的蛋白的细胞内观察。多家公司都提供荧光蛋白标签载体 ,如Clontech、Life Technologies等。

Clontech最近还推出了一些新产品,包括光转换蛋白载体 。Dendra2是来源于八放珊瑚(Dendronephthya sp)的单聚体荧光蛋白质,其荧光可由绿色转换成红色。转换之后,红色荧光增强150-300倍,而绿色荧光降低10-15倍。因此,红色-绿色荧光比值的增加产生了约400倍的对比度。它是示踪蛋白动态 (蛋白质的移位、降解等) 和实时监测选定细胞行为的理想选择。

PAmCherry则是荧光蛋白mCherry的光激活突变体,它一般不发光,而在350-400 nm光下暴露一会儿之后,会发出红色荧光。这种荧光蛋白具有较快的成熟速度和较高的对比度以及更大的量子产率,因此具有更好的应用前景。它目前已应用在超高分辨率显微镜(如PALM和STORM)中。

Timer则随着时间的推移慢慢地从绿色变成红色。只要检测红、绿光的比率(重叠时为黄色),就可以推测出这个启动子开启和关闭的时间,也就可以确定目的蛋白的表达时间和存在时间。

这种荧光蛋白为实时研究启动子的调控时效提供了可能:在活细胞或者活的生物体内,你不但可以看到某个启动子什么时候、在什么位置开始启动基因的表达,还可以观察到它什么时候关闭表达。

功能控制标签

Clontech也提供一些蛋白功能控制标签,例如iDimerize和ProteoTuner标签。iDimerize标签让研究人员可利用特异配体使目的蛋白二聚化,实现蛋白之间相互作用的精确、实时控制。

只需要将Dmr结构域与您的目的蛋白融合,并转染到目标细胞,表达融合蛋白。当培养基中添加了细胞通透性的二聚化因子(dimerizer)时,这种因子促使融合蛋白质亚基之间互相靠近,可以模拟在某种调控条件下,细胞内蛋白质的二聚化过程。

ProteoTuner标签则更为神奇,堪比魔术师。它让研究人员能利用小分子调控细胞内任何目的蛋白的表达水平。当12 kD的DD结构域与目的蛋白融合时,就成为蛋白酶体降解的目标,从而破坏蛋白的稳定。

而一种名为Shield1的配体可保护DD融合蛋白免受降解,使融合蛋白在细胞内累积。稳定作用只需15-30分钟即可完成,让用户可监控快速诱导蛋白的影响,比传统的四环素诱导方法更快。

多功能的标签

若您还未考虑好该用什么颜色,或者希望使用一些更灵活的标签,那么也有很多产品可以选择,比如Promega的HaloTag®、Life Technologies的Lumio,以及NEB的SNAP-tag、CLIP-tag、ACP-tag和 MCP-tag等。每个系统都是独特的,但基本原理一致,将目的蛋白与另一个蛋白或肽段融合,后者可与检测或捕获试剂特异结合。这种策略让我们可标记或纯化蛋白。

Promega的HaloTag系统就是将目的蛋白与一种经过修饰的酶(HaloTag蛋白)融合,这种酶可与氯化烷烃底物共价偶联。如果底物与荧光染料结合,那么您的蛋白就成了荧光标记的蛋白。如果底物附着到固定表面,那么就是固定化的蛋白

。一些HaloTag特异的表面(称为HaloLink),包括磁珠和非磁珠以及HaloLink Protein Array System,可利用这种方法捕获和展示蛋白质。索取更多资料

总之,选择多种多样,HaloTag带来了荧光蛋白所没有的灵活性。有了荧光蛋白,您必须固定在一种颜色。而有了HaloTag,您可以在多种配基中选择,红的绿的,细胞通透的,非通透的。这是传统的荧光蛋白所不能给予的。

我们可以利用HaloTag技术成像活的或固定的哺乳动物细胞,监测 HaloTag 融合蛋白在细胞内部的迁移,观察亚细胞结构或蛋白更新周期。也能够实现从细胞到凝胶的分析,可以从活细胞、或体外转录/翻译反应中,通过固相载体获得HaloTag融合蛋白或者蛋白复合物。

如果您对上述HaloTag技术的应用感兴趣,而又不知从何入手,这里有篇文章刚好适合您:《4个步骤,玩转HaloTag多功能融合标记蛋白》。

Invitrogen的Lumio技术和HaloTag有点相似,是基于FLAsH( Fluorescein Arsenical Hairpin)技术,通过在目的蛋白中融合“Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys”(4xCys + 2 除Cys外的任意氨基酸)片段,与一种联胂类荧光素衍生物耦合,使后者发荧光,从而实现蛋白的实时观测分析,并且可以通过电泳直接分析蛋白。

Lumio的优势在于6个氨基酸的小Tag(大约0.5 kD)对目标蛋白影响较小;而且底物不发光,结合Tag后才发光,所以本底很低,不需要洗去未结合底物。Lumio的底物目前只有红色和绿色荧光2种,前者对细胞形态有影响,发光稳定性差,多推荐用绿色。

New England Biolabs(NEB公司)也推出了蛋白质标记SNAP-tag新技术,可将哺乳动物细胞体内蛋白质成像并且体外捕获蛋白质。为了使用方便,NEB目前提供两套系统:一套是标记物可以自我标记构建好的融合蛋白(SNAP-tag和CLIP-tag),另一套是标记物通过酶促标记蛋白(ACP-tag和MCP-tag)。

SNAP-tag和CLIP-tag技术能将目的蛋白以共价键的形式,特异地标记上任何分子。SNAP-tag来自人烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。此酶是一种DNA修复蛋白,它的底物是一类苄基嘌呤和嘧啶的衍生物,包括苄基鸟嘌呤。标记反应时,底物的苄基部分被替换,与SNAP-tag形成共价键。

操作时应包括两个步骤:亚克隆目的蛋白,使其与SNAP-tag形成融合蛋白;选择理想底物标记SNAP-tag。CLIP-tag是由SNAP-tag衍生而来,经过基因改造,使其不与苄基鸟嘌呤衍生物结合,而与苄基胞嘧啶衍生物结合。这样,与SNAP-tag联合使用时,CLIP-tag能够同时标记同一个细胞中的两个不同蛋白。

与荧光蛋白相比,SNAP-tag系统具有一些优势。首先,荧光蛋白是一直“开”的,而带标签的蛋白只有在加入荧光基团后才发光。用户只需要选择不同的配基,即可改变蛋白的颜色。此外,这一系统利用有机的荧光基团,通常比荧光蛋白更亮。对于高要求的应用,如超高分辨率显微镜和单分子成像,荧光蛋白的光物理性质就不如有机染料好。

NEB提供多种底物:一些是细胞通透性的,能特异性标记活细胞内带有SNAP-tag的融合蛋白,也能标记细胞表面或体外带有标签的融合蛋白;另一些是细胞非通透性的,通常用于标记活细胞表面融合有SNAP-tag的蛋白。除了荧光标记物,还有生物素标记物,让用户可将自己的荧光基团或捕获试剂与SNAP-tag或CLIP-tag配基偶联。

体内标记

对于in vivo标记,人们通常用化学标记的营养物喂养细胞,让它们掺入新合成的蛋白、核酸或代谢物。之后收获细胞,分离出这些分子,从整体上查看细胞行为,或利用抗体或其他捕获试剂来研究某个蛋白。

蛋白质组研究人员常用的方法是SILAC,即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。两组细胞同时培养,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。

然后将两组细胞混合,提取出蛋白质组,并交给质谱去测定,从而评估两种条件下的蛋白丰度差异。之前对此技术有详细介绍,请看《定量蛋白质组学之SILAC技术》。

而非质谱研究人员则使用所谓的生物正交(bioorthogonal)化学反应。在生物正交系统中,人们使用带有化学基团的分子来喂养细胞,这些化学基团与天然的生物活性基团(如胺基或羧基)不起反应。外源化合物(包含该基团的反应partner)的添加引发化学反应,从而将带标签的生物分子与功能基团偶联。

赛默飞世尔提供试剂,让叠氮化物与膦基团(phosphine group)偶联。在实验中,您可以用带有叠氮化物的分子来喂养细胞,然后,用含有膦基团的试剂处理细胞,它们就会发生反应。这两种化学基团一般不存在于生物系统中,因此这些分子是惰性的。

举个例子,在培养HK-2细胞时,您可以用N-azidoacetylmannosamine来标记新合成的糖蛋白。之后,用DyLight 650-phosphine处理,观察这些蛋白。

赛默飞世尔目前提供三种不同颜色的膦基团(DyLight 488-Phosphine、DyLight 550-Phosphine和DyLight 650-Phosphine),以及生物素标记的膦基团,用于蛋白分离。

Life Technologies也有类似的点击化学试剂,名曰Click-iT,相当形象,不过它是基于铜催化的叠氮化物和炔烃之间的共价反应。当然,它也提供不含铜的试剂版本,用于活细胞应用,因为铜对于活细胞是有毒性的。

叠氮化物和炔烃都是惰性、稳定的,而且相当小。这些基团可交换,也就是说您可以选择一个来标记目标分子,而另一个用于随后的检测。Click-iT反应可监控新生蛋白的合成或抑制,取代BrdU检测细胞增殖,鉴定翻译后修饰(如糖基化和棕榈酰化)。标记试剂有7种可供选择,包括6种荧光基团和生物素。

这些试剂也可用于脉冲追踪实验。首先,用含有叠氮化物的分子和炔烃染料来标记新合成的蛋白,一段时间后,用含有炔烃的分子和不同颜色的叠氮化物染料来喂养细胞,就可以分辨新合成的蛋白与之前的蛋白。

体外标记

最后一类蛋白标签是在体外标记蛋白。除了常用的反应性化学试剂(如NHS酯),一些公司也提供蛋白标记试剂盒,可实现多重质谱分析。这些试剂盒以同量异序标签(isobaric tag)标记蛋白。这些标签有着相同的分子量,因此在质谱上表现相同,但它们以不同的方式片段化,可在串联质谱分析中区分开来。

Life Technologies的iTRAQ试剂盒包括8种同量的胺活性试剂,能够对蛋白质水解的肽段进行标记,结合串联质谱的方法,可对肽段进行精确的鉴别和定量。这种技术通量高,一次可实现多达8个样品的蛋白质鉴定。它也能用于多个时间点蛋白质组动态变化的监测。

iTRAQ技术的大体流程如下:样品一般先经胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段,利用iTRAQ试剂多重标签对所产生的肽段进行差异标记,再将标记样本混合,最后用LC-MS /MS进行分析。iTRAQ试剂包含8种不同的胺活性试剂。

每种胺活性试剂与水解后肽段集合。胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。

iTRAQ技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,因此近年来应用较广。它适合所有类型的蛋白样品,而不像SILAC,不能对组织来源的蛋白进行分析。也正因为如此,它容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染,需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染。

赛默飞世尔也推出了串联质谱标签(tandem mass tag)试剂盒,被称为TMT,用于标记实验。TMT包含带有氨基活性基团的等量的串联质谱标签,一个质量归一化的连接子,一个可断裂的化学键,和报告离子 (reporter ion)系列。

使用这些试剂,研究人员能在一个样本中专门标记肽和蛋白,然后进行相对或绝对的定量。该方法能够分析一个样品中每一个单独的蛋白,最多可同时分析6个样品。

不过,赛默飞世尔很快将会把TMT产品线升级为新的iodoTMT产品。据介绍,iodoTMT试剂只标记含有半胱氨酸的肽段,而传统的TMT试剂标记所有肽段。

因此,研究人员可使用iodoTMT来研究不同条件下半胱氨酸特异的修饰,比如S-亚硝基化(S-nitrosylation)、氧化和二硫键。赛默飞世尔也提供固定化的anti-TMT树脂,可富集那些包含半胱氨酸的低丰度肽段,否则它们可能无法检测。

蛋白标签的选择真的很多,具体选择哪一个,这取决于您的应用。每个系统都不是完美的,都有优点和缺点。在选择之前您需要考虑:标签有多大?它是否会干扰相互作用?这个标签系统有多少种颜色可选?是否与您的应用兼容?当然,多看文献肯定没错。

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