蛋白质组学

脂肪组织和细胞的总蛋白提取

脂肪组织特别是白色脂肪组织(WAT)已经被证实除了具有能量储存功能外,还与内分泌和器官炎症有关。从脂肪组织中提取和分析蛋白质对于了解许多生理 / 病理状态越来越重要。但是由于白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)中高脂肪和低蛋白含量,所以在技术上极具挑战性。

众所周知目前生物样品中水油乳化物最难分离,具有独特表面性质的带孔径的离心管柱和优化的无表面活性剂的缓冲液系统,可以快速有效的从脂肪组织匀浆中将水油乳化物分离。提取缓冲液比脂肪组织中的油冰点低,脂肪组织匀浆通过离心管柱能将水相和油相迅速分开,组织中的总蛋白无丢失。蛋白质得率可达 2-3 mg/ml,远远高于其他方法。

柱式法 Minute TM 脂肪组织和细胞的总蛋白提取操作步骤:

从脂肪组织中提取蛋白(白色脂肪组织或棕色脂肪组织)

1. 将缓冲液 A,离心管柱和接收管套管放置于冰上预冷。

2. 秤取 50-80 mg 新鲜或冷冻脂肪组织,把它放在几层纸巾上,用拇指和食指挤压,从组织中去除一部分油。用镊子将组织放入试剂盒提供的 1.5 ml 离心管中,秤取 100 mg 蛋白提取粉加入样品中。加入 50 ul 缓冲液 A。

3. 用研磨棒扭转研磨组织样品 1-2 分钟成浆状。再加入 200-300 ul 缓冲液 A,继续研磨样品 30 秒钟。如果起始组织量较小(20-40 mg)需要加入 100-150 ul 缓冲液 A。

4. 盖上盖子,2000 rpm 离心 1 分钟。将上清液转移到放置在接收管里的离心管柱中(研磨棒可以重复使用,用酒精擦拭清洁,空气干燥)。

5. 在 - 20℃,开盖孵育 15-20 分钟。(请确保冰箱温度在 - 20℃附近,否则参照下面的常见问题)

6. 孵育后立刻在 2000 rpm,开盖离心 1-2 分钟。弃去离心管柱,所得为脂肪组织中的总蛋白。提取出的蛋白中含有少量不溶物为非水溶性细胞组分。可以将其稀释后直接用于 ELISA 检测水溶性蛋白。也可以用缓冲液 B 或 C 重悬溶解非水溶性蛋白用于下游应用:

A. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 B 成为变性蛋白溶液(用于 SDS-PAGE,Western 和其他应用)或者

B. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 缓冲液 C 成为非变性蛋白溶液(用于 IP,ELISA 和其他应用)或者

C. 用 2X 的 2D 胶样品缓冲液溶解用于 2D 分析。

注意:缓冲液 A 中含有可能会感染质谱分析的组分。如果提取的蛋白用于质谱分析,在提取前需透析缓冲液,或者用 TCA 法沉淀蛋白。

从脂肪细胞中提取蛋白

1. 低速离心收集 50-100 million 脂肪细胞。在 1.5ml 离心管中加入 1ml 预冷的 PBS(可根据上述建议加入磷酸酶抑制剂或者蛋白酶抑制剂)重悬细胞。加入 100 mg 蛋白提取粉

2. 3000 rpm 离心 3 分钟,弃去上清液。用研磨棒扭转研磨 1-2 分钟使细胞匀浆。加入 200-300 ul 缓冲液 A,继续研磨 30 秒。

3. 2000 rpm 离心 1 分钟,然后将上清液转移到预冷的离心管柱接收管套管中。接转以上步骤 5-6

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