蛋白质组学

大肠杆菌表达载体/穿梭载体/整合载体

蛋白表达技术全攻略

一、大肠杆菌表达载体

大肠杆菌表达载体 都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求,即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件,就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。

1.表达融合蛋白的表达载体

当蛋白质表达以后,有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达,并利用载体 编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 (Tag),常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST) 、六聚组氨酸肽(polyHis-6) 、蛋白质 A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。

1.1 表达 LacZ 融合蛋白的载体

如 pEX1/2/3 载体(图 3-31),P R 受 cIts857 控制,宿主 M5219 含缺陷性原噬菌体,编码 cIts857 和 N 蛋白。 cIts857 强烈抑制基因转录。 N基因可使 RNA polymerase 跨过基因内部潜在终止位点。 一般采用 42-45 ℃灭活 cIts857 阻遏物,此处采用 40℃ 以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。因为温度转换不仅可诱导 PL/PR 启动子,也可诱导热激基因,而后者有些可编码蛋白酶。

1.2 表达 GST 融合蛋白的表达载体

GST 表达载体在启动子 tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列,其一是谷胱甘肽转移酶基因,其二是凝血蛋白酶(Thrombin)切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后,可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 GST 是来源于血吸虫的小分子酶( 26kDa),在 E.coli 易表达,在融合蛋白状态下保持酶学活性,对谷胱甘肽有很强的结合能力。

将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱,当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时,融合蛋白将吸附在树脂内,其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱,可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白,便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外,其它还有 Xa 因子(Factor Xa)和肠激酶。

1.3 利用 T7 噬菌体启动子的表达载体

表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体(图 3-32),其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后,就可在特定的宿主细胞中诱导表达。大肠杆菌中 T7 启动子表达调控模式图见图 3-33 。

1.4 分泌型表达载体

除了在细胞内表达外,还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解,或使表达的蛋白正确折叠,或去除 N-- 末端的甲硫氨酸,从而达到维护目标蛋白活性的目的。

利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外,可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质 A 的信号肽。

表达载体 pEZZ18 的表达元件有 lac 启动子、蛋白质 A 的信号肽序列和两个合成的 Z 功能域(domain)(图 3-34)。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质 A 具有与抗体 IgG 结合的能力, Z 功能域就是根据蛋白质 A 中结合 IgG 的 B 功能域而设计的。融合蛋白表达后,在信号肽序列的指导下,分泌到培养基中。然后用固定了 IgG 的琼脂糖层析柱,通过与 ZZ 功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个 14kDa 的 “ZZ” 肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。

2.非融合蛋白表达载体

2.1 pKK223-3 表达载体: M77749 4584bp

pKK223-3 载体 4584bp(图 3-35)。使用的启动子:tac 强启动子,杂合启动子 trp-lac ;终止子: 5SrRNA 区域(rrnB 操纵子区域),rrnBT 和 rrnBT2 终止子( 防止通读)。受 lac 阻抑物调控, 1-5mM IPTG 诱导。 可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因,若无 RBS,其 ATG 需与固有RBS相隔5-13bp。

2.3 其它

二、穿梭载体

穿梭载体(Shuttle vector)是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制,或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。

1.大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体

大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体,其作用主要是将目标基因转移到芽胞杆菌或球菌中去。

2.大肠杆菌/酵母菌穿梭载体

酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥重要作用外,在作为蛋白质的真核表达系统方面也显示出巨大威力。

大肠杆菌 - 酿酒酵母穿梭质粒载体,含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记,另有一个多克隆位点区。由于此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制,也可在酿酒酵母细胞中复制,因此在遗传学研究中很受欢迎。它使研究工作者可自如的在两种不同的寄主细胞之间来回转移基因,并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。

3.其它穿梭载体

在哺乳动物、植物、昆虫细胞等细胞中使用的表达载体或其它载体,一般都有在大肠杆菌中复制的元件,因此都具备穿梭载体的特征。

三、整合载体

在生物学研究和基因工程应用中,会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作,承担这部分工作的载体,可称为整合载体(integration vector)。根据整合方式的不同可分为定点整合和随机整合,按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。

1.基因插入 / 基因敲除

同源重组整合载体是最常用的整合载体,该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架,更主要的是含有一段便于同源重组的重组 DNA 片段。也就是从染色体上待插入位点处取出一段 DNA, 将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组 DNA 片段。

2.随机插入突变载体

随着功能基因组研究的发展,不断需要一系列发生基因突变的材料。为了满足这一要求,构建随机突变体库便进入到研究工作中。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。 为了提高标记基因插入到基因组中的频率,一般都要借助转座子来帮忙。

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