蛋白质组学

蛋白质的等电点测定和沉淀反应

 

一、蛋白质等电点的测定
1、 目的:了解蛋白质的两性解离性质;学习测定蛋白质等电点的一种方法。
2、原理:蛋白质是两性电解质,蛋白质分子 的解离状态和解离程度受溶液酸碱度影响。当溶液的PH达到一定的数值时,蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等,在电场中,蛋白质既不向阴极移动也不向阳极移动,此时溶液的PH值称为此种蛋白的等电点。不同的蛋白质的等电点各不相同。在等电点时,蛋白质的理化性质都有变化,可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
3、材料与试剂
0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 200ml(取0.8g酪蛋白,加少量水在乳钵中仔细研磨,将所得的蛋白质悬胶液移入200ml的锥形瓶中,用少量40-50℃的温水洗涤乳钵,将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10ml1M醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中,并小心地旋转锥形瓶,直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至200ml的容量瓶内,加水至刻度,定容。1.00M醋酸溶液 100ml;0.10M醋酸溶液 100ml;0.01M醋酸溶液
4、仪器
水浴锅、温度计、200ml锥形瓶、100ml容量瓶、吸管(1ml、10ml)、试管、试管架、乳钵
5、操作
(1)取相同规格的试管4支,按下表顺序分别精确地加入各试剂

试管号 蒸馏水(ml) 0.01M醋酸(ml) 0.1M醋酸(ml) 1.0M醋酸(ml)
1 8.4 0.6
2 8.7 0.3
3 8.0 1.0
4 7.4 1.6

(2)向以上试管中各加入酪蛋白的醋酸钠溶液1ml,加一管,摇匀一管。此时1、2、3、4管的PH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后,再观察其混浊度。最混浊的一管的PH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性
1、目的:加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识;了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义;了解蛋白质扁形与沉淀的关系。
2、原理:在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电离层而成为稳定的亲水胶体颗粒,在一定的理化因素影响下,蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类:(1)可逆的沉淀反应:如蛋白质的盐析作用和在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时常用。(蛋白质分子的结构尚未发生显著变化);(2)不可逆沉淀反应:如加热引起的蛋白质沉淀与凝固或与重金属或有机酸的反应(蛋白质分子内部结构发生重大改变)。蛋白质变性后,有时维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷),并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
3、材料与试剂
蛋白质溶液 500ml(5%卵清蛋白溶液或鸡蛋蛋清的水溶液 新鲜鸡蛋蛋清:水=1:9)PH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲溶液 100ml;3%硝酸银溶液 10ml;5%三氯乙酸溶液 50ml;95%乙醇 250ml;饱和硫酸铵溶液 250ml;硫酸铵结晶粉末 1000g;0.1M盐酸溶液 300ml;0.1M氢氧化钠溶液 100ml;0.05M碳酸钠溶液 100ml;0.1M醋酸溶液 100ml;甲基红溶液 20ml;2%氯化钡溶液 150ml
4、操作
(1)蛋白质的盐析:无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同,析出的蛋白质也不同。加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中,再加等两的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀,加少量水,观察是否溶解,为什么?将管内容物过滤,向管内添加硫酸铵粉末到不溶解为止,此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白,加少量蒸馏水,观察沉淀的再溶解。
(2)重金属离子沉淀蛋白质:重金属离子与蛋白质结合生成不溶于水的复合物。取1支试管,加入蛋白质溶液2ml,再加3%硝酸银溶液1-2滴,振荡试管,有沉淀产生。放置片刻,倾去上清夜,向沉淀中加入少量水,观察现象解释原因。
(3)某些有机酸沉淀蛋白质:取1支试管,加入蛋白质溶液2ml,再加入1ml5%三氯乙酸溶液,振荡试管,观察沉淀的生成。放置片刻,倾出上清夜,向沉淀中加水观察现象,解释原因。
(4)有机溶剂沉淀蛋白质:取1支试管,加入2ml蛋白质溶液,再加入2ml95%乙醇。混匀,观察现象。加水再观察解释原因。
(5)乙醇引起的变性与沉淀:取3支试管,编号。依下表顺序加入试剂:

  5%卵清蛋白溶液 0.1M氢氧化钠 0.1M盐酸 95%乙醇 PH4.7缓冲溶液
1
2
3
1
1
1

1


1
1
1
1
1

振摇混匀后,观察各管有何变化。放置片刻,向各管内加入8ml水,然后在第2、3号管中各加入一滴甲基红,再分别用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化何沉淀的生成。每管再加0.1M盐酸溶液数滴,观察沉淀的再溶解。解释原因。

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