蛋白质组学

植物叶蛋白的提取

 

一、实验目的
熟悉植物 叶蛋白的几种提取原理和方法,了解其意义及其应用价值。
二、实验原理
植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leaf protein concentration,简称LPC),是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质,不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质,而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为数甚多的植物体内,对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。
天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态,故LPC 亦称叶蛋白胶。其特点是:
(1)水化作用 即蛋白质分子 表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜;(2)电荷排斥作用 水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态;(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法),利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法);还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素,即可使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。
植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则:尽可能提高样品蛋白的溶解度,抽提最大量的总蛋白,减少蛋白质的损失;减少对蛋白质的人为修饰;破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用,并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则,植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂①离液剂:尿素和硫脲等;②表面活性剂:又称去垢剂,早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂,离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS 等,还有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent 等双性离子去垢剂;
③还原剂:DTT、DTE、TBP、Tris-base 等;④蛋白酶抑制剂及核酸酶:EDTA 、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktails)等,如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子,可在其中加入0.1~5mmol/LEDTA,同时使金属蛋白酶失活。
三、仪器和试剂
仪器
离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。
试剂
1. 20mL 样品提取缓冲液:2.5mL 0.5mol/LTris-HCl

3. -20℃下预冷丙酮(含0.07%β-巯基乙醇)
4. -20℃预冷的80%丙酮(含0.07%β-巯基乙醇)
5. 饱和硫酸铵溶液 称取(NH4)2SO4 80g,加蒸馏水100mL,加热50~60℃,搅拌溶解,室温过夜,用浓氨水调pH 至7.0

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