蛋白质组学

IPTG诱导pET载体目的蛋白表达的原因分析

 

1)噬菌体DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株,噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株,构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中,诱导蛋白的表达方式与lac启动子一样都是IPTG诱导。

2)表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因,T7 RNA 聚合酶编码基因以及lacUV5启动子,lacUV5启动子可以启动T7 RNA 聚合酶的表达;

3)表达质粒 如pET-28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白lacI的基因,在插入目的基因后,lacI是失活的;

4)在非诱导条件下,表达菌株中表达出的lacI阻遏蛋白可以作用于T7 RNA 聚合酶前的lacUV5启动子,从而抑制T7 RNA 聚合酶的表达。IPTG是乳糖类似物,可以与阻遏蛋白lacI结合,使其对lacUV5启动子失去阻遏作用,T7 RNA 聚合酶得以合成,继而与pET-28质粒上的T7启动子结合,启动下游基因包括目的基因的表达,从而产生目的蛋白。

pET-28质粒的基因图谱

需要注意的是:

由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍可能有痕量的本底表达,控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖,有助于控制本底表达水平。

二是采用带有T7 lac启动子的载体——这些质粒在紧邻T7启动子的下游有一个lac操纵子序列。它们同样带有常规启动子以及编码lacI阻遏蛋白的序列,T7lac和 lacI启动子位置交错。采用这种载体及DE3溶原菌,lac阻遏蛋白既可以作用于宿主染色体lacUV5 启动子,抑制宿主聚合酶转录T7 RNA聚合酶,也可以作用于载体T7lac 启动子,从而阻断任何 T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子的区别在于蛋白表达 的严紧性不同。T7 lac启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列,属于高严紧性的启动子。该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录。而普通的 T7 启动子表达量更高些。

如果这还不够,更为严谨调控手段还有在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶,降低本底表达。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE,相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化,前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多,对细胞生长影响小,而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平,容易出现过度调节,增加蛋白表达的滞后时间,从而降低表达水平。

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