蛋白质组学

LORRY法蛋白定量的实验步骤和需知事项

 

蛋白定量 的方法主要有以下三种:BCA法、考马斯亮蓝法和Lorry法。其中LORRY法蛋白定量也就是利用菲林-酚试剂法对蛋白质含量进行测定的实验方法。本文主要对其实验步骤进行介绍。

[原 理]

斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应:第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肤键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5~l00μg蛋白质)。

(一)材料

各种植物 材料。

(二)仪器设备

722分光光度计,离心机,恒温水浴,定量加样器,冷凝回流装置一套,研钵,离心管,刻度移液管,微量滴定管,试管等。

(三)试剂

(1)0.5mol/L Na0H。

(2)斐林—酚试剂甲液:由A、B两种溶液组成:

A液:4%碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液:1%硫酸铜(CuS04•5H20)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成,此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林—酚试剂乙液:称取钨酸钠(Na2W04。H20)100g,钼酸钠(Na2Mo04•2H20)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450mL,浓Hcl 100 mL,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4.H2O)150g,蒸馏水50ml,溴水2-3滴,打开瓶口煮沸15min,以逐出过量的溴,冷却后溶液呈黄色(若仍绿色,须再滴加几滴溴水,继续煮沸15min)。待冷却后稀释至1000ml,过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol/L酸度。因此在使用前应进行标定。标定方法:取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内,用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定,酚酞作指示剂,当溶液突然转红再转灰绿时,即为滴定终点。计算其相当的酸度,用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L的酸度。

在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性稳定,但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。

⑷标准蛋白质溶液:称取25mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使终浓度为250μg/ml。

[实验步骤]

(一)标准曲线的绘制

(1)取18mm×200mm试管7支,1-7编号,分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1mL,使每管含蛋白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。

(2)用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液,混匀,于30℃下放置10min。

(3)再向试管中喷射加入0.5mL乙液,立即振荡混匀,在30℃下准确保温30min

(4)以不加标准蛋白的1号管为空白,在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

(二)样品的测定

样品的提取:称取鲜样0.5g,用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,10000 r/min离心10min,取上清液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)于试管中,然后重复标准曲线绘制中的2~4步骤,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。

[结果计算]

样品中蛋白的含量==C×VT/(Vs×FW×1000)

式中:C为查标准曲线值,μg;VT为提取液总体积,mL;WF为样品鲜重,g;Vs为测定时加样量,mL。

注意事项

还原物质,其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

LORRY法蛋白定量是蛋白测定中最灵敏、应用范围最广的方法之一,适于5~l00μg蛋白质的定量,在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。

(0)

热评文章

发表评论