蛋白质组学

SPA提取IgG

 

(一) 原理
将SPA偶联至Sepharose-4B上后,利用亲和层析 来提取人和某些动物的IgG,这样可以省去制备第二抗体。该法特别适用于单克隆抗体的研究。该法提取IgG与利用IgG纯化SPA原理是一致的。

(二) 材料与试剂
1.Sepharose-4B琼脂
2.SPA
3.溴化氰
4.0.10Mol/L NaHCO3液
5.pH3.2盐酸-甘氨酸液
6.生理盐水
7.待提取的IgG样品
8.层析柱 (2cm×10cm)
9.磁力搅拌器
10.751分光光度计

(三) 操作方法
1.Sepharose-SPA的制备 在50ml三角烧瓶中加入蒸馏水20ml,加入固体溴化氰1.4g,加盖后温和振荡,使之溶解。倒入已盛有琼脂糖珠(4B)的烧杯中,立即搅拌,并滴加2mol/L NaOH溶液,边加边搅拌,使pH维持在11。反应6min后,倒入布氏漏斗,迅速以预冷的0.1mol/L NaHCO3溶液500ml抽滤洗涤已活化的琼脂糖珠。洗涤时间不超过90Sec,立即将此琼脂糖珠加入预先以0.1mol/L NaHCO3平衡的SPA液10ml中(10mg/ml),于4℃搅拌16h~20h,此即为Sepharose-SPA的吸附剂。
2.将Sepharose-SPA低速离心5min,以生理盐水洗涤2-3次,除去未偶联上的SPA,然后装入2cm×10cm层析柱中,用生理盐水200ml洗至洗液OD280nm<0.02。
3.亲和层析 将欲提取的IgG样品用生理盐水做1:5稀释后,加入Sepharose-SPA层析柱,以生理盐水洗脱,流速20ml/h。IgG被柱上的SPA吸附住,其它蛋白质随洗脱液流出。以生理盐水洗至洗脱液的OD280nm<0.02为止。
4.解吸附 以pH2.0盐水-甘氨酸缓冲液进行洗脱,将洗脱下来的蛋白液迅速以1mol/L的NaHCO3液中和至pH 7.0,此即为提纯的IgG。
5.将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度后,浓缩、分装、低温保存备用。
6.Sepharose-4B-SPA柱复生 采用7mol/L尿素洗柱后,再用生理盐水洗涤,最后用PBS液平衡后,可重复使用。

(四)结果判定
1.IgG的收集量。
2.IgG的纯度鉴定 可采用圆盘电泳或免疫电泳进行鉴定。
3.IgG的活性鉴定 可采用抗该IgG的ELISA试验,以鉴定IgG的活性。

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