蛋白质组学

酵母表达外源蛋白

 

1、 菌株

用GS115表达不出蛋白,换KM71H后,大部分克隆 能表达。

2、温度:
 在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低。

3、pH

手册上用6.0,pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA,最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氢钾调,具体比例自己去试试。
 

4、偏爱密码子

codon bias一般不是主要的问题,你要表达的蛋白特性才是主要问题,酵母对分子量大(30KD以上),结构复杂(如一些蛋白酶),二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达,尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达 量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体,29KD,含有2对二硫键,表达量约几毫克每升,选用酵母偏好密码子全基因合成后,表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒 转化对照

诱导时间长了以后,是会有很多蛋白分泌出来的,时间越长杂蛋白就越多,且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照,这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染

每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管,比LB管大一点),纱布一般用8层,一天左右看着比较浑离心,留样1ml,余1ml换2ml BMMY诱导表达,3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的,只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后,就再没遇到过污染。如果只用6层纱布,污染的可能当然很大,100ml三角瓶,装量10ml培养液,用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口,空气浴摇床。

7、不表达

蛋白有没有表达就要看你的运气了,一般重复2-3次实验都没有表达菌株,这个蛋白就放弃表达了。

8、表达量

30KD,10mg/L表达量已经很高,最直接的方法是发酵,一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

 

9、糖基化

酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的,有如下序列:N X S/T就是潜在的糖基化位点,X为任意氨基酸,1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话,但是无法预测其位点,不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达,不存在糖基化的问题。

 

10、表型与表达

重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换,结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快,消耗的甲醇多,后者生长慢,消耗的甲醇少,所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多,但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好,只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。

11、培养基

YPD:最基本的培养用;BMGY:诱导表达前培养用;BMMY:诱导表达用;MD:电转化后筛选his+用。
YEPD是不能代替BMGY的,因为有葡萄糖,这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的,就是用YPG培养基代替,只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替,也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比,甘油残余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇,在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。

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