蛋白质组学

酚试剂(Lowry)法测血清蛋白质含量

 

一、 相关理论
1、 血清(浆)蛋白质是血清(浆)固体成分中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化和物。
2、 血清(浆)蛋白质的分类:
目前已研究的有300 余种,已分离提纯的有100 余种,大部分在肝脏合成。
1) 盐析法可将血浆蛋白分为白蛋白(Albumin, Alb 或
A)和球蛋白(Globulin, G)2 种
2) 醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5 种
3) 琼脂 糖凝胶电泳可分为13 种
4) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)可分为30 多种
5) SDS-Page 可分为300 多种。
3、 血清(浆)蛋白质的功能:
1) 维持血浆渗透压 2)运输作用
3) 营养作用 4)缓冲作用
5)免疫作用 6)凝血作用
7)催化作用
4、 测定蛋白质含量的意义:
1) 实验室测定蛋白浓度可推测蛋白质的总量和纯度
2) 农牧业、食品加工业和发酵工业蛋白质定量分析也是一种重要手段
3) 在医学领域,人体体液中总蛋白质和某些特定蛋白质的测定,可作为疾病诊断治疗和病程观察的重要指标
二、 常用测定方法(总蛋白)
1、 凯氏(Kjeldahl)微量定氮法:
1) 原理:在生物样品中,蛋白质含氮量相对恒定,为16%,即1 克氮相当于6.25 克蛋白质,由于其它非蛋
白质含氮化合物所占的氮量甚微,故可通过测定样品中的含氮量来推算其蛋白质含量。
2) 特点:历史悠久(1883 年),结果较准,但方法复杂、费时。一般不用于常规检测。
2、 双缩脲法:
1) 原理:利用蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu++作用产生紫红色络合物(双缩脲反应),在一定范围内,颜色反应强度与蛋白质含量成正比。
2) 特点:简单、精密、准确(干扰因素较少),为首选方法,但灵敏度稍差(最低测定值 100ug)。
3、 酚试剂法:
1) 原理:Folin 1921 年首创,利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基(酚基)还原酚试剂(磷钨酸-磷钼酸)起蓝色反应。1951 年,Lowry 对此法进行了改进,先于标本中加碱性铜试剂,再与酚试剂反应,提高了灵敏度。
2) 特点:灵敏度高(最低测定值 1ug),但易受还原性物质的干扰。
4、 紫外分光光度法:
1) 原理:利用蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸残基在280nm 由吸收峰,进行比色测定。
2) 特点:灵敏度较高(最低测定值 10ug),操作简单,但仪器价格昂贵,易受其它因素干扰(尿素、胆红素),需将蛋白质分离纯化后再测。
5、 染料结合法:
1) 原理:酸性情况下,带正电的蛋白质与带负电的染料(如考马斯亮蓝G-250)结合呈现一定的颜色。
2) 特点:灵敏度高(最低测定值 1ug),操作简单,干扰因素较少但特异性不高。
三、 实验:酚试剂(Lowry)法测血清(总)蛋白质含量
1、 目的及要求
1) 掌握酚试剂法测血清蛋白质的原理
2) 掌握制作标准曲线的方法
2、 原理
1) 碱性条件下,蛋白质(血清)+铜生成蛋白质-铜复合物
2) 蛋白质-铜复合物使磷钨酸-磷钼酸还原,生成蓝色物质
3、 试剂(略)
4、 操作
1) 血清的稀释(1:500)
2) 标准曲线的制备:按下表操作(单位:ml)

混匀,30min 后,以第1 管为空白管,在650nm 处比色,读取各管光密度,并以其为纵坐标,各管蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。
5、 计算
1) 以A 测读数查标准曲线求得血清蛋白质含量
2) 以第6 管为标准管,计算:

6、 注意事项
1) 加入酚试剂时动作要快并立即摇匀,不应出现混浊
2) 标准曲线制备:3、5、7 管平行,各管A 之差不得超过0.005,否则删去,取平均值;最好呈45o 直线。
7、 临床意义
1) 总蛋白增加:血液浓缩(严重腹泻、呕吐、高热、休克);合成增多(多发性骨髓瘤G)
2) 总蛋白减少:

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