蛋白质组学

优化生物工艺研发的创新性技术定量分析蛋白聚集体

蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中,蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法,可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。
 
近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品,可以准确地定量检测蛋白聚集,加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的ProteoStat® protein aggregation assay,可对蛋白检测方法进行优化。在这篇文章中,使用已知浓度的聚集IgG标准品作为标准曲线,通过ProteoStat®protein aggregation assay/standards对IgG的聚集水平进行检测,集中分析了制药工业中常见的3种聚集形式:热诱导聚集、机械诱导聚集、冷冻和反复冻融诱导聚集。
 
材料和方法
ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards(购自Enzo ),利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽,在微孔板中即可检测。探针在溶液中是不发出荧光的,当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组,它们将含有0-12.5%的聚集蛋白,总蛋白浓度维持在1mg/ml。通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为2-10um,约9%的蛋白聚集体长度为10-20um,约0.7%的蛋白聚集体为长度大于20um。
 
Synergy™Mx Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments) 可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为500nm,发射波长为600nm,激发和发射狭缝宽度为9nm,便于检测ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激发单色器激发波长为435nm,发射波长为495nm,都在激发和发射狭缝宽度为9nm的条件下进行检测。
 
结果
在96孔微板中检测比较ProteoStat和Thioflavin T染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊lgG(4.26 mg/ml)在pH2.7的盐酸水溶液中,80℃温度下孵育90分钟后会形成蛋白聚集体。聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的,但总的lgG蛋白浓度仍然是60 ug/ml。在50 mM磷酸钾,pH 7,3uM ProteoStat 检测试剂或5uM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验,已经确定是最优的浓度。
 
在蛋白和染料一起孵育15分钟后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader读数。所用的板为Greiner μClear® black, clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。在相同情况下,ProtesStat染料的荧光强度比Thioflavin T染料高100倍。对于浓度为1.2 ug/ml的聚集体,ProteoStat染料的信噪比为12.8,而Thioflavin T染料的信噪比仅为1.2,表明ProteoStat染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。
 
监控热诱导聚集
当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊lgG(4mg/mL)在各个时期都处于搅拌速度400rmp,100mM磷酸钠,pH7.2,温度60℃下。
 
在每个时间点,25ul lgG用于测量。首先样本在1x assay buffer中稀释4倍后,得到的蛋白最终浓度为1 mg/ml。在每个孔中加入98ul的检测蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution,每个时间点都做平行孔。
 
同时,ProteoStat protein aggregation standards中含有稳定的、高质量的对照样本,用来做标准曲线。
 
如图1所示,使用ProteoStat染料检测羊lgG在热诱导下的聚集情况,生成的曲线表明不同阶段lgG蛋白聚集的情况。在刚开始阶段蛋白聚集情况较少,接着观察到生长阶段聚集体开始形成,最后生长率降低直至变成0,表明蛋白单体已几乎消失,差不多完全形成聚集体。
 
图1:热诱导羊IgG蛋白聚集
 

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