蛋白质组学

蛋白的生物活性测定方法

 

结晶紫法活性测定
1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞,用0.25%胰酶(以无钙镁离子PBS溶液配制,pH7.4)消化后,加入RPMI-1640培养基(10%新生牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素,pH7.2)吹打细胞,使形成细胞悬液。进行细胞计数,使细胞数为2~2.5×105个/ml。接种于96孔细胞培养 板,100µl/孔。接种细胞时须不断摇动细胞悬液,以保证各孔细胞数的均匀一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h,观察到孔中细胞长满70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D,使终浓度为1.5µg/ml,配成样品稀释液。取此稀释液900µl至eppendorf 管中,另在9个5ml管中加入700µl稀释液。
3、用完全培养基将基因工程 人肿瘤凋亡素样品(上海恰尔生物技术有限公司研制,批号:0304,冻干粉剂,蛋白浓度:2mg/支)复溶至1000µl(液体样品测定蛋白浓度后,直接进行下一步操作),取出100µl至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中,充分混匀,尽量不起泡沫。再从此管中吸出100µl至下一管中,如此反复n次(即测定前10倍稀释若干次,直到与估计活性相接近时)。
4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中,充分混匀。再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl稀释液的5ml管中,如此反复9次(即测定时倍比稀释样品)。
5、弃去96孔板中旧的培养基,从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中,每个稀释度作6复孔(n=6);从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中,依此类推,直至第10排孔结束。第1排中不含细胞,加入100µl/孔含有放线菌素D的稀释液作空白对照;第11排加100µl/孔稀释液作细胞对照;第12排加不含放线菌素D的RPMI-1640完全培养基。
6、将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO2培养箱中继续培养22h,显微镜下观察细胞形态变化,初步判断结果。
7、弃除培养板中的培养基,每孔加入100µl染色液(1.5mmol/L结晶紫)染色30min。洗去染色液,甩去水分并在吸水纸上拍打以使干燥。冲洗程度以在吸水纸上拍打时,没有颜色出现为宜。
8、充分干燥后,每孔加入100µl33%浓度的冰醋酸,在振荡仪上充分振荡使结晶溶解。设定λ=595nm酶联检测仪测定各孔的吸光值,据此数据进行统计学处理,计算出对细胞50%杀伤时所需的基因工程人肿瘤凋亡素的浓度。

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