蛋白质组学

LOWRY法和考马斯亮蓝法测定植物可溶性蛋白含量对比

 

植物 体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在 465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0~100μg/ml),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计 ,10ml量筒1支;研体;10ml容量瓶1支;1ml刻度吸管3支;10ml具塞刻度试管14支。

【试剂】

(1)牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml;

(2)考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月;

(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%,W/V)。

【方法】

1.标准曲线的绘制

(1)0~100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管,按表28-1数据配制0~100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml 考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。

表28-1 配制0~100μg/ml血清白蛋白液

管&NBS p; 号 1 2 3 4 5 6
100μg/ml牛血清蛋白 量(ml)
蒸馏水量(ml)
蛋白质含量(mg)
0
1.0
0
0.2
0.8
0.02
0.4
0.6
0.04
0.6
0.4
0.06
0.8
0.2
0.08
1.0
0
0.10
&NBS p;

(2)0~1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管,按表28-2数据配制0~1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤(1)操作相同,绘出0~1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0~1000μg/ml血清蛋白血液

管      号 7 8 9 10 11 12
1000μg/ml牛血清白蛋白(ml)
蒸馏水量(ml)
蛋白质含量(mg)
0
1.0
0
0.2
0.8
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
0.4
0.6
0.8
0.2
0.8
1.0
0
1.0

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后在595nm下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。

3.结果计算

样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=

式中 C-查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);

V-提取液总体积(ml);

a-测定所取提取液体积(ml);

W-取样量(g)。

二、LOWRY法

【原理】

Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展,其原理是:蛋白质溶液用碱性铜溶液处理,形成铜-蛋白质的络合盐,再加入酚试剂后,除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此,Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3~15倍,为双缩脲法100 倍。由于肽键显色效果增强,从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成,试剂甲相当于双缩脲试剂(碱性铜溶液),可与蛋白质中的肽键起显色反应;试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应,因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色,颜色深浅与蛋白质含量成正比。

【仪器与用具】

试管若干;刻度吸管0.5ml,1ml,10ml;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管一套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl;分光光度计。

【试剂】

Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85% H3PO4;浓HCl;Li2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NaOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;

牛血清白蛋白:用水配成250mg/ml。

【方法】

1.酚试剂的制备

(1)取Na2WO4·2H2O 100g,Na2MoO4·2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中,之后加入85% H3PO4 50ml,浓HCl 100ml。安上回流冷却装置(使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时,必须用锡泊包起来),使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4·H2O 150g,水50ml,浓HCl 100ml安上回流冷却装置,开口加热煮沸15min,以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存。

使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度,用时适量稀释,使最后浓度为1mol/L H+,此为Folin-酚试剂乙液。

(2)首先配制①4% Na2CO3溶液;②0.2mol/L NaOH溶液;③1% CuSO4溶液;④2%酒后石酸钾钠溶液;使用前①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液;将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50︰1混合;配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。

2.标准曲线的绘制

(1)取7只试管编号,分别加0ml,0.1ml,0.2ml,0.4ml,O.6ml,0.8ml,1.0ml标准蛋白质溶液,用水补到1ml,便成为每管含蛋白为0mg,25mg,50mg,100mg,150mg,200mg,250mg标准系列(必要时可做重复)。

(2)加5ml试剂甲,混匀,于30℃放置10min。

(3)喷射加入0.5ml试剂乙,立即振荡混匀,在30℃下保温30min。

(4)准确到30分后,以不加标准蛋白的管为空白,在500nm波长下比色测定吸光度值。

(5)以蛋白浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。

3.样品测定

(1)取50μl样液加入试管中,(样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例,提取方法见各酶活测定)加蒸馏水补至1ml,然后重复步骤2的(2),(3),(4),以空白为参比,测吸光度值。

(2)根据吸光度值,查标准曲线求得蛋白质含量。

4.结果计算

蛋白质含量(mg/g鲜重)=

式中 C-查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量(mg);

V-提取液总量(ml);

a-测定时取样液量(ml);

W-取样量(g)。

【注意事项】

1.Folin试剂乙只在酸性条件稳定,故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前,还原反应即能发生。

2.为了保证反应进行完全,反应在25~30℃水浴中进行,反应30min后准时比色。

3.还原物质干扰本实验。

【方法评述】

上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法,前者稳定,后者简便;二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是:Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰;考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低,且不同蛋白质与色素结合状况有差异。

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