蛋白质组学

酶的提取、分离、纯化及其活力测定

 

一、实验目的
酶是植物 体内具有催化作用的蛋白质,植物体内的生化反应,一般都是在酶的作用下进行的,没有酶的催化反应,植物的生命也就停止了,因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来,加以分离、纯化,不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同,有些工作只需要粗的酶制剂即可,而有些工作则要求较纯的酶制剂,需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中,自始至终都需要测定酶的活性,通过酶活性的测定以监测酶的去向。

二、实验原理
(一)酶的提取
1.酶的存在位置?
存在于动植物以及微生物 的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离?
从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题,首先是细胞中含有许多种酶,每种酶的浓度又很低,只占细胞总蛋白质中的极小部分(叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外),而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外,各种酶的存在状态不同,有在细胞外的外酶,在细胞内的内酶,内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶,也有的存在于细胞质中,提取时都应区别对待,作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中,只要将细胞破碎,酶就会转移到提取液中;但如果是与细胞器(如细胞壁、细胞核 、线粒体、原生质膜、微粒体等)紧密结合的酶,这时如仅仅破碎细胞还不够,还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次,细胞中存在抑制物质,如酚,酸,离子等,它们通常在液泡中,当细胞破碎时,这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来,进入提取液中,特别是酚类物质,具有游离的酚羟基,能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键,不能为一般的实验方法,如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌,醌为一种强氧化剂,会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合,使蛋白质上的反应基团,如—SH,—NH2,通过1,4—加成反应而发生不可逆的聚合作用,使酶失活,也使植物组织和提取液产生棕色,以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要,一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗,在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响,一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液,因为在高pH值时,酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键,但高pH值促进酚类氧化,同时降低酚类吸附剂(如PVP)的有效性,通常采用pH6.7梍7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物,是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP,提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP(Polyvinyl polypyrrolidone,简称PVPP,或Polyclar AT),能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体,可加10% HCl煮沸10分钟,用NaOH中和,再用水洗几次,直至中性,纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。
植物细胞有坚韧的细胞壁,需要强烈的方法去破碎,少量样品可用研钵加石英砂研磨,或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热,所用器皿和溶液需要预冷,提取液的用量一般为组织的1梍5倍,用量大些有利于提高得率,但工作量大,一般宁可用量小些,将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP,金属螯合剂Na2─EDTA,以及─SH化合物以保护蛋白质,或加入非离子型去垢剂如Triton X─100,以增加蛋白质的可溶度,常用于与膜脂结合的酶。总之,可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。
(二)分离和纯化
1.酶的粗提液是否只有酶,有没有其它物质?
上面制备得到的提取液中,除含有所需要的酶外,还含有其他蛋白质,以及其他大分子和小分子化合物杂质。
2.如何将酶从粗提液只分离纯化?
要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白,目前常用的方法有盐析法,往层析法,薄膜超滤法,亲和层析法,电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一,迄今仍广泛使用,而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性,利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低,盐析法就是利用这一性质,将不同性质的蛋白质分离,选择合适饱和度的硫酸铵,使沉淀的蛋白质的酶活性最大。大多数酶的活性存在于35梍45%和45梍55%饱和度硫酸铵沉淀的部分,但也有存在于65梍80%饱和度的(如花椰菜根的过氧化物酶)。沉淀的蛋白质经离心后收集之,再溶于少量缓冲溶液中,经透析或凝胶柱过滤,以除去硫酸铵及其他小分子杂质,然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同,又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同,分子筛类型凝胶过滤柱层析,洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了,亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析,往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱,最方便的是线性梯度浓度,当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪,如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样,已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了。
近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力,这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物,如琼脂糖(Sepharose)将底物、竞争性抑制剂或辅酶,以共价键的形式连接到支持物上,然后把含有酶的溶液,流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱,酶即被保留在支持物上,再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质,然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液,进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适,往往能得到较高纯度的酶,是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。

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