蛋白质组学

离子交换柱层析法分离可溶性蛋白的操作规范

 

通常,可溶性蛋白可通过离心、盐析、电泳和层析来分离。本文介绍可溶性蛋白离子交换柱层析 操作规程:包括了装柱、柱的平衡与上样、洗杂蛋白、解离目的蛋白以及柱的清洗与保存操作规范。

1.装柱:

1.1 取出层析柱,用去离子水 冲洗干净,连接好管子后固定柱子;

1.2用水冲洗层析柱 3-5次,每次10ml去离子水;

1.3取出填料,静止至室温后,根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱,

1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积;

2.柱的平衡与上样:

2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱,直至流出液的pH为7.6;

2.2对处理的样品进行过滤后,缓慢上样让蛋白充分结合;

3洗杂蛋白:

3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白,至流出液与缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

(具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)

4解离目的蛋白:

4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱,共洗约30ml,至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止,流出液取20ul做SDS-PAGE检测;

(具体的洗脱梯度需根据实验自行调整)

5.柱的清洗与保存:

5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱,共冲洗30ml;

5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱,共冲洗30ml;

5.3用过滤去离子水冲洗50ml;

5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

可溶性蛋白是植物生理实验例如植物抗寒性、植物抗逆性的重要指标。离子交换柱层析是分离可溶性蛋白的方法之一,本文提供该实验的一般操作流程,具体的参数如洗脱度还需根据实际的实验情况作自行的调节。

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