蛋白质组学

蛋白质电泳-在蛋白质组学中的应用

 

原 理
蛋白质分子 在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒,并可在电场内移动,其移动方向取决于蛋白质分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨基酸组成及所在溶液的pH值,携带的静电荷不尽相同,致使它们在电场中的迁移率各异,从而达到分理的目的。
电泳原理示意图

蛋白质组 学中对电泳的分类
一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE),现在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)
二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE),又称双向电泳

一维电泳
现在普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),包括非变性电泳(native PAGE)和SDS-PAGE两种,前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。后者是在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS),蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹,消除了它们间原来携带的电荷差别,因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小,故广泛用于蛋白质分子量的测定。
凝胶浓度和蛋白质分离范围

缓冲液的选择
通常在SDS-PAGE均选择Tris-glycine作为电泳的缓冲系统。但在大部分缓冲系统中,SDS微团(micelle)会干扰小分子蛋白质的分离,而Tris-tricine系统则可使小蛋白质-SDS复合物与微团分离,去除干扰。此外,也证明该系统对脂多糖和脂寡糖混合物的分离有效。

12%胶常用的低分子量标准蛋白

名称来源分子量磷酸化酶B兔肌肉97400牛血清白蛋白牛66200卵清蛋白鸡蛋清45000碳酸酐酶牛31000胰蛋白酶抑制剂大豆21500溶菌酶鸡蛋清14400

一维凝胶染色
现在用于凝胶中蛋白染色的方法包括氨基黑10、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝R350、银染、铜染及橙染(sypro orange)。最常用的为考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝R350染色,为了提高灵明度采用银染。
一维电泳的应用
初步测定蛋白质的分子量
初步分离蛋白质复合物,并进一步用于免疫组化分析
对重组表达蛋白的初步鉴定
将一维电泳和生物质谱相结合,达到对较简单蛋白复合物的分离和鉴定

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