蛋白质组学

胰蛋白酶的纯化

 

[原理]
胰蛋白酶与另外两种蛋白水解酶:糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)和弹性蛋白酶同时存在于胰脏中。由于胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的酶蛋白分子在结构上及其它很多性质上的相似之处,往往在一般的制备过程中很难将它们彼此彻底分开,传统的分离、纯化技术难以达到十分满意的结果,但采用亲和层析 技术,大大提高了分离纯化的效果。
鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂,对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用(而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用)。在pH7.6~8.0的范围内,猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上,在pH2.5~3.0的范围内,能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此,采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂,可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。反应的基本原理如下:

胰蛋白酶亲和层析流程示意图

亲和层析需要选择耐用的,非特异性吸附少的,水不溶性的载体,此载体并可在温和条件下与配基能共价偶联,而又不影响配基原有的生物学特性。琼脂 糖凝胶颗粒,具有机械强度高、通透性好、非特异性吸附少等优点,目前作为亲和层析载体使用最广泛。
琼脂糖作为亲和层析基质使用最广泛。为了增加琼脂糖的稳定性和提高机械强度,在碱性条件下加入环氧氯丙烷进行交联,并适当加入一些硼氢化钠,以还原除去琼脂糖中某些不利于层析的离子基团(如硫酸基)。珠状交联琼脂糖,在接上配基之前,需要活化。活化方法很多,溴化氰活化最常用,但该化合物极毒。
本实验方法一使用染料“对β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)”与琼脂糖反应生成ABSE-琼脂糖,经重氮化反应后与卵粘蛋白配基偶联,制得胰蛋白酶的亲和吸附剂。亲和吸附剂制备过程主要反应如下:

实验中方法二采用用环氧氯丙烷活化,再与卵粘蛋白配基偶联的方式。最后制备亲和层析柱 纯化胰蛋白酶。
本实验采用自制珠状交联琼脂糖经活化、偶联制备亲和吸附剂。

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