蛋白质组学

小鼠β

 
    动物组织 RNA 的提取

实验目的: 掌握由动物组织中提取总RNA的方法

实验原理: Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液,其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性,随后加入氯仿,酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同,造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中,RNA则分布在上层的水相中,最后用异丙醇沉淀水相中的RNA,并用70%乙醇洗涤沉淀,这样就可以得到比较纯净的总RNA.

实验步骤:

① 先在研钵中加入液氮,再将组织剪成 块在液氮中磨成粉末,用液氮预冷的药匙取50~100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中(注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%),充分混合均匀。

② 室温放置5min,然后加入200µl的氯仿,盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③ 12000rpm离心10min,取上层水相于一新的EP管中(千万不要将中间的沉淀层和下层液混入,否则重新离心分离),加入500µl异丙醇,温和颠倒混匀。室温放置10min,12000rpm离心10min。

④ 小心地弃去上清液,加入1ml的75%乙醇,涡旋混匀,4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。

⑤ 弃去上清液(尽量将残余液体除去),室温或真空干燥5~10min(注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度)。用30µl DEPC处理过的水将RNA溶解,必要时可55℃~60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

另外,还可以通过试剂盒提取总RNA, 操作步骤见试剂盒说明。

    扩增目的基因及 糖电泳分析

实验目的: 掌握通过RT-PCR方法由真核生物的总RNA中获得目的基因的方法,并通过琼脂 糖电泳对扩增结果进行定性检测。

实验原理: 由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾,这样以olig(dT)为引物,在逆转录酶的催化下,就可以合成互补DNA(cDNA),然后以cDNA为模板,利用目的基因扩增引物进行PCR 就可以扩增出目的基因。

实验步骤:

RNA 的反转录

① 在 EP管中依次加入

RNA模板 3 μl

Olig(dT)18引物 1μL

DEPC H2O 8 μL

混合后,70℃水浴5 min(破坏二级结构),再冰浴5min。

② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL):

RT 5×buffer 4μL

RNasin 1μL

dNTP ( 10mM) 2μL

混匀,37℃ 5min。

M-MULV反转录酶 1 μL

置于 42℃水浴,1h。

③ 70℃保温5min(使酶失活)。

④ 于-20℃保存备用。

PCR 扩增目的基因

以反转录产物为模板,克隆引物B1,B2为引物,利用rTaq酶进行扩增目的基因,用于后续连入克隆载体的操作,然后再以表达引物EB1,EB2为引物,利用Pfu DNA聚合酶进行扩增目的基因,用于后续连入表达载体的操作。

94 ℃ 3 min
 

94 ℃ 45Sec

30 cycles: 57 ℃ 45Sec

72 ℃ 45Sec

72 ℃ 5min

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