蛋白质组学

DNA分子的限制性内切酶消化操作流程

限制性核酸内切酶产品选择专题

一、限制性内切酶 对DNA消化的方案

1.限制性内切酶 反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2. 20μl体积反应体系如下:

DNA 0.2-1 μg

10×酶切buffer 2.0 μl

限制性内切酶 1-2 u(单位)

加ddH2O 至 20 μl

限制性内切酶 最后加入,轻轻混匀,稍加离心,放置于最适温度水浴并按所需的时间温育,一般为37℃水浴消化3hr。

3.用于回收酶切片段时,反应总体积可达50-200μl,各反应组分需相应增加。

4.多种酶消化时若缓冲液条件相同,可同时加入;否则,先做低温或低盐的酶消化,再做高温或高盐的酶消化。

5.酶切结束时,加入0.5M EDTA (pH 8.0)使终浓度达10mM,以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。

6.如消化反应体积过大,电泳时加样孔盛不下,可加以浓缩:终止反应后,加入0.6体积的5M乙酸铵(或1/10体积3M NaAc)和2倍体积无水乙醇,在冰上放置5min,然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中(pH 7.6)。

7.如要纯化消化后的DNA,可用等体积酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次,再用乙醇沉淀。

二、电泳检测

取质粒酶切产物适量,加适当loading buffer混匀上样,以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体(如有)作对照,采用 1-5V/cm的电压,使DNA分子从负极向正极移动,至合适位置取出置紫外灯下检测,摄片。

三、注意事项

1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释,切勿用水稀释以免酶变性。

2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中,于-20℃是稳定的。进行酶切消化时,将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀,再从-20℃冰箱中取出酶,立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头,以免酶被污染。加酶的操作尽可能快,用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3.尽量减少反应体积,但要确保酶体积不超过反应总体积的10%,否则酶活性将受到甘油的抑制。

4.通常延长时间可使所需的酶量减少,在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5.注意星号酶切活力。

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