蛋白质组学

E.coli的GST标记蛋白表达及纯化

蛋白表达技术全攻略

本指南介绍了大规模和小规模GST蛋白表达 和纯化的方法。由于蛋白的多样性,因此推荐先进小规模表达及纯化测试。

材料与试剂

1. IPTG (Sigma)

2. 咪唑 (Sigma)

3. 蛋白酶抑制剂 (Roche)

4. 溶菌酶(Sigma)

5. 谷胱甘肽 琼脂 糖 4B 珠 (Pierce 15160)

6. 谷胱甘肽(Pierce 78259)

7. NP-40 (sigma)

仪器

1. 远距离声波定位器(超声仪)

步骤

1. 小规模表达和纯化测试

1) 接种E. coli到5 ml培养基( 用于2xYT )37 °C过夜振摇 (12~16 hours),。

2) 第二天,按1:20将其稀释到新鲜的2xYT培养基。在37 °C 振摇至 OD600 达 0.6~0.8。按 E.coli 株系和状态,一般需要2-3 hrs。

3) 加入0.1 mM IPTG诱导。分别在0 hr,1 hr, 2 hrs, 4 hrs及过夜取出 10 ml培养基, 离心后在液氮速冻,保存与-80 °C。

4) 当所有的样品收集好之后,在沉淀中加入1.5 ml 裂解缓冲液 (50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mMNaCl, 10 mM 咪唑, 1x 蛋白酶抑制剂, 1 mg/ml 溶菌酶),重悬沉淀。冰上孵育 30 min。

5) 每个样品超声处理15 s,2次。

6) 最大转速4 °C离心30 min,以分离上清和沉淀。1.5 ml 裂解缓冲液重悬沉淀。分别取10 μl上清和重悬液为样品。

7) 加入10μl谷胱甘肽琼脂 糖4B 珠,4 °C孵育 1 hr并用 200 μl 1 x PBS洗3次。离心后收集上清。

8) 10 μl洗脱缓冲液(20 mM谷胱甘肽, 75 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl)清洗柱子。

9) 每一步取的样品进行合适浓度的 SDS-PAGE,以确定表达纯化的条件和蛋白表达 量。

注:如果有溶解性的问题,尝试降低IPTG浓度和表达温度。

2. 大规模表达和纯化

1) 接种 50 ml E.coli在 37 °C过夜培养。

2) 稀释过夜培养物到 1 L, 37 °C振摇直到 OD600=0.4-0.8。

3) 0.1 mM IPTG诱导并在 37 °C培养适当时间。

4) 4000× g , 10 minutes ,4 °C离心收集细胞。液氮速冻并保存于 -80 °C。

5) 室温水浴解冻细胞。置于冰上,用5-7× 沉淀物体积的裂解缓冲液重悬细胞(参见小规模测试的配方,含蛋白酶抑制剂和溶菌酶)。冰上孵育30 min。

6) 个样品超声处理15 s,3次,直到黏度降低。确保裂解物温度不超过10 °C。留下 10 μl为样品。

7) 40,000× g, 4 °C离心30 min,沉淀蛋白。上清和沉淀留取样品。

8) 根据小规模诱导估计的GST蛋白量和纯化情况,以及谷胱甘肽琼脂糖吸附珠的吸附量(按照说明),加入适量珠子。为确保纯度,加入的蛋白应多于吸附珠的容量。

9) 加入1% NP-40以减少非特异吸附。 4 °C孵育30 min

10) 吸附的浆液用一次性容器收集并收集滤液 。

11) 用20×珠子体积的 PBS洗涤珠子并收集滤液。

12) 加入1×珠子体积的洗脱缓冲液,收集洗脱产物。

13) 重复上一步骤5次。

14) 洗脱之后,取少量珠子,样品中加入 SDS上样缓冲液。

15) 从裂解物,沉淀物,上清,滤液,洗脱缓冲液和吸附珠子取到的样品进行SDS-PAGE 检测。

16) 收集含有带着GST标签的蛋白经 PBS 在 4 °C透析至少 1 hr,3次。

17) 液氮速冻并保存于 -80 °C。

配方

1. 2xYT 培养基

细菌蛋白胨 16g

酵母提取物 5g

NaCl 5g

H2O 800 ml

调整 pH=7.2

加 H2O到 1L.

高压灭菌

2. PBS 缓冲液 (pH=7.4) (1 L)

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

Na2HPO4 1.44 g

KH2PO4 0.24 g

H2O 800 ml

调整 pH to 7.4

用重蒸水定容到 1 L

高压蒸汽灭菌

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