蛋白质组学

种子蛋白质系统分析:种子蛋白质组分分析

 

一、目的
种子蛋白质由10%-15%的原生质蛋白质(复合蛋白质)和85%-90%的贮藏蛋白质(简单蛋白质)组成。Osbome 在种子中发现与分离出来清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白等4 个组分。不同作物种子中各蛋白组分比例有很大差异,不同蛋白组分的必需氨基酸含量也不相同,通常醇溶蛋白中缺乏Lys、Trp、Met 及Ile 等必需氨基酸,其营养价值最低。因此,根据种子蛋白质组 分的相对含量,可以评判蛋白质的品质。通过本实验学习并掌握用连续累进提取法分离种子蛋白质各组分。

二、原理
根据清蛋白可溶于水、球蛋白溶于稀盐溶液、醇溶蛋白溶于乙醇、谷蛋白可溶于稀碱或稀酸溶液的性质,可用不同溶剂把这4 种组分从样品中分离提取出来。然后用凯氏法分别定量或利用SDS-Page 进行各组分亚基分析。

三、仪器、试剂和材料
1.仪器
( 1)日本MRK 公司产VS - KT-P 自动定氮仪
( 2)样品磨
( 3)玻璃层析柱
2.试剂
( 1 ) 50%异丙醇(V / V)或70%乙醇
( 2 ) 3%硼酸
( 3 )0.5mol / L NaCI
( 4 )0.l mol / L NaOH

四、操作步骤
1.制样
谷物籽粒风干,用样品磨粉碎,放干燥器中备用。
2.装柱
在玻璃层析柱底部过滤筛板上置一层滤纸。称取酸洗并经540℃ 高温处理的石英砂 60g,样品2g 装入三角瓶中混匀,每个样品重复3 次,设空白对照。另称取石英砂20g,其中10g 置于层析柱底部,将三角瓶中混合物装入柱内,再将剩余的10g 石英砂加入层析柱上部。装好后用小木棒轻轻敲打把空气排出。
3.提取
在提取前加20rnl 蒸馏水,排出柱内气体,浸湿样品,然后按下列步骤进行。
( 1)加100ml 蒸馏水调节流速为0.5ml / min,提取清蛋白,定容于100ml 容量瓶中。
( 2)加100ml0.5mol / L NaCI 提取球蛋白,定容于100 ml 容量瓶中。
( 3)加100ml 70%乙醇提取醇溶蛋白,定容于100ml 容量瓶中。
( 4)加100ml0.1 mol / L NaOH 提取谷蛋白,定容于100ml 容量瓶中。
4.提取液中蛋白质含量测定
( 1)从每一容量瓶中吸取10ml 提取液放入消化管中(摇匀后再吸)。然后加3ml 浓浓硫酸,2.5g 催化剂。用150℃ 加热0.5h 蒸干溶剂,然后用200℃消化0.5h , 400℃ 消
化0.5h。
( 2)消化管自然冷却后,即可用自动定氮仪进行含氮量测定。
5.样品总蛋白质含量测定
每一样品称取0.2g ,重复3 次,然后按本实验I 方法用自动定氮仪测定含氮量。

五、结果处理
( l)计算样品中蛋白质含量。
( 2)计算各蛋白组分在样品中的含量及占总蛋白质的比率。

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