蛋白质组学

免疫球蛋白提取技术:IgG的分离与提纯

 

免疫球蛋白 (Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。
随着免疫学 的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫 球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

一、 IgG的分离与提纯

(一)材料与试剂配制
1.动物血清
2.硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
3.0.01Mol/L pH7.4PB液

4.1%BaCl2溶液
5.纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。
6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。
8.透析袋(或玻璃纸)。
(二)操作方法
1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%((NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3 000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6. 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
7. 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8. 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无 SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9. 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。
12.IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。

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