蛋白质组学

SPA的提取、纯化与鉴定

 

(一) SPA的提取
SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下:
1.煮沸提取法
⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂 培养基上,37℃培养20h~24h。
⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下,配成10%(V/V)的悬液。
⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷却至4℃,4 000r/min离心20min,去沉淀。
⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5,然后4 000r/min离心30min。
⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min离心20min。
⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,.4 000r/min离心20min。
⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS 液溶解,12 000r/min离心20min。
⑻ 上清液即为粗提SPA液。
⑼ Sephadex G100过柱,上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。 ⑽ 测OD275nm值及用对流免疫 电泳检测每管的活性,将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2.溶菌酶消化法
⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。
⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。
⑶ 置4℃冷却后,以12 000g离心30min。
⑷ 取上清,调pH值至7.0。
⑸ 加硫酸铵,边加边搅拌,使溶液呈80%的饱和度,4℃过夜。
⑹ 12 000g离心30min。
⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。
⑻ 透析或过Sephadex G50除盐,即为粗制的SPA制品。

(二)SPA的纯化
1.DEAE-Sephadex A-25离子交换层析法
⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-25柱。
⑵ 加样后,用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h~14h。
⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱,流速0.15ml~0.2ml/min,收集流出液,测OD275nm。
⑷ 测SPA活性(以对流免疫电泳),能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。
⑸ 浓缩或冻干保存。
2.Sphadex G100凝胶过柱法
装柱、加样,以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱,收集洗脱液,如上法测定活性和蛋白含量。
3.亲和层析法
(1) 猪IgG的制备:取正常猪血清,硫酸铵提取γ球蛋白,再过DEAE-纤维素-32柱,制得纯化的IgG,以0.1mol/L NaHCO3液平衡,配成4mg~5mg/ml溶液。
(2) 偶联:将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中,倾入容积为15ml的Sepharose-4B中,搅拌,同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0,反应8min,用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose-4B(在90Sec内洗脱完毕),迅速加入IgG液15ml,于4℃缓慢搅拌过夜,次日以PBS充分洗涤,至洗出液OD280nm<0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱,以封闭残余活性基团,再以PBS洗至中性为止。
(3) PBS亲和层析:将粗制SPA溶于PBS液中,加入IgG-Sepharose-4B柱,流速0.2ml/min,以PBS洗至OD280nm<0.02为止,换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱,流速0.2ml/min,收集洗脱液,即为纯化的SPA,对流电泳检查SPA活性,收集,浓缩,保存。

(三)纯化SPA的鉴定
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,只出现一条沉淀带为纯品。据报道,常出现一条杂蛋白染色带。以亲和层析法提纯的纯度高。

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