蛋白质组学

多肽合成常见问题及解答

 

Q:如何保存合成的多肽?
A:多肽在-20℃很稳定,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,在将它们暴露于空气之前, 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。
  对于含Cys, Met orTrP的多肽,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽可易空气氧化, 在封瓶前,慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比,生命期有限。
Q:多肽的溶解性怎样?都溶于哪些溶剂?
A:大多数肽的首选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽, 需要DMF(二甲基甲酰胺)、脲、guanidinium(胍盐)、chloride(氯化物)或acetonitrile(乙腈)来溶解,这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
  残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。
  您需要特殊的多肽或任何技术帮助,请随时与我们联系。 我们包你完全满意,对于我们不能适当合成的顺序,我们不收费。
Q:多肽的保存如何操作?
A:包装 1mg或更少的多肽按净重包装,声明的小瓶重不含相关抗离子和水。 例如,氨基酸分析决定的肽含量是80%, 在1mg样品中,那么瓶中毛重是1.25mg。
  大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水, 例如,25mg样品中肽百分比为90%,那么,实际肽量为25mg×90%=22.5mg
  不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%, 而肽含量相关带电基团(如Arg, Lys )的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。
  所有产品应存于冰箱, 最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。
  溶液肽远比冻干形式不稳定,溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的,为避免样品的反复冻融, 最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完, 应扔掉,细菌 降解有时会成为溶液肽的麻烦, 为克服此,肽应溶于无菌水, 或肽溶液用0.2μ M滤膜过滤。
Q:如何重建多肽重建过程如何操作?
A:多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时,要注意使初始浓度比要求浓度大,如果多肽仅有限溶解性, 这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
  如果多肽在水中的溶解性有限,有几种选择可帮助溶解:
  对碱性肽用稀乙酸(含Arg , Lys , His)
  酸性肽用稀氨水(含Asp, Glu)
  对极疏水的肽用10%有机修饰物(acetonitrile , Methanol)
  极不溶的肽用DM50或DMF
  guanidine hydrochloride或脲的浓溶液也很有用, 与上述方法合用, 声处理也是溶解多肽的有效手段。
Q:HPLC分析是什么? 如何利用HPLC纯化多肽
A:分析HPLC使用柱子和泵系统,可以经受传递高压,这样可以用极细的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
  HPLC分两类:离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用,通过可变PH, 离子强度, 或两者洗脱出多肽,通常, 先用低离子强度的溶液,以后逐渐加强或一步一步加强,直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
  反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱, 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成,这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的, 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而,总体实践中, 这两类柱互变无多少显著差别,别类载体由碳水化合物构成, 比如苯基。
  典型的操作常由两绶冲剂组成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m).。大量各种缓冲剂含许多不同试剂,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸, 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨,TFA/TEA,磷酸钠或钾,异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂,但要注意一点:硅反相柱料不能长时间暴露于高pH,甚至微碱pH, 因为这样会破坏柱子。

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