蛋白质组学

蛋白质的性质实验

 

【目的和要求】
1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。
3. 加深对蛋白质胶体分子 稳定因素的认识,了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。
【实验原理】
(一) 蛋白质及氨基酸的呈色反应
蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构,可以与某些试剂反应,生成有色物质。
1. 双缩脲反应
尿素被加热至 180℃左右时,两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。

所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。
蛋白质或二肽以上的多肽分子中,含有多个与双缩脲结构相似的肽键,因此也有双缩脲反应,可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
2. 茚三酮反应
蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外,其他氨基酸生成紫红色,最终为蓝色化合物。
除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外,氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。该反应灵敏度达1:1500 000(pH5-7)。现已广泛地用于氨基酸定量测定。
3. 黄色反应
凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应,需加少量浓硫酸才有黄色反应。
(二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定
蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时,蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等,以兼性离子状态存在,在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动,也不向阳极移动,这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH值低于蛋白质等电点时,即在 H+ 较多的条件下,蛋白质分子带正电荷成为阳离子,当溶液的pH值大于等电点时,即在OH—较多的条件下,蛋白质分子带负电荷成为阴离子。

本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点,在等电点时蛋白质溶解度最小,最容易沉淀析出。

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