蛋白质组学

葡聚糖凝胶柱层析纯化PPO粗酶液

 

一、原理

1.葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析 利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外,而小分子物质进入凝胶颗粒内部,流速慢而最后流出柱外,凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。(G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质)

2.利用离子交换法,选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料,因为PPO是带有阳离子的蛋白质,在层析时会吸附在柱材料上,而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO,(NaCl为强离子交换剂,能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来)。粗酶液从而得到纯化。

二、材料与试剂

试剂:0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA )配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇;DEAE-纤维素DE52;葡聚糖凝胶SephadexG-200;兰葡萄糖-40、70、100等;

实验器械与仪器设备 :试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等;试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机

三、操作步骤

1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

(1)柱材处理

称取一定量的SephadexG-200干粉,加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒,为防止凝胶颗粒中的空气存在,影响层析效果,凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉,其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中,进行抽真空处理,直到凝胶液中没有气泡出现为止。

(2)装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液(凝胶的浓度过高会产生气泡,影响蛋白质分离速度,浓度过低易产生凝胶分层,影响蛋白质的分离效果)轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱,剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出液口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。

(3)平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA),平衡SephadexG-200凝胶。

2.上样:将粗酶液上柱。

3.洗脱:用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)洗脱,收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

4.DEAE-纤维素的处理及装柱

(1)处理

本实验采用的是DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂,具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中,去除杂质;再在0.5N的HCL溶液中浸泡1-2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上,并将其在抽滤漏斗中抽干;将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1-2h,再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。

(2)装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材,轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。

(3)平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA),预先将DE-52柱进行平衡。

5.上样:

将洗脱酶液上样,用0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001MEDTA)洗脱杂蛋白。

6.洗脱:

用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001MEDTA)进行梯度洗脱。

7.测定酶活性和蛋白质浓度。

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