蛋白质组学

蛋白质提取与制备(Protein Extraction and Preparation)

 

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多,性质上的差异很大,既或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的体系中,因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异,主要取决于蛋白分子 中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。
将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化硫等)中,可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物,如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质,最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂,将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物,即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH 用适当缓冲液控制时,共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中,脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷(Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。

一、蛋白质类别溶解性质的介绍
简单蛋白质:
白蛋白
球蛋白:溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液,可被50%饱和度硫酸铵析出。
真球蛋白:一般在等电点时不溶于水,但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。
拟球蛋白:溶于水,可为50%饱和度硫酸铵析出
醇溶蛋白:溶于70~80%乙醇中,不溶于水及无水乙醇
壳蛋白:在等电点不溶于水,也不溶于稀盐酸,易溶于稀酸、稀碱溶液
精蛋白:溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀
组蛋白:溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀
硬蛋白质:不溶于水、盐、稀酸及稀碱
缀合蛋白:包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等。 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异,除脂蛋白外,一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中,脂蛋白如脂肪部分露于外,则脂溶性占优势,如脂肪部分被包围于分子之中,则水溶性占优势。

二、蛋白质提取与制备概述
蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽有了不少改进,但其主要原理仍不外乎两个方面:一是利用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的,如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化,也不能蒸发,所能分配的物相只限于固相和液相,并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法;按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法;按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析 及吸附层析等;按生物功能专一性有亲合层析法等。
由于不同生物大分子结构及理化性质不同,分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同,使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究,查阅有关文献资料,对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解,然后再着手进行实验工作。对于一个未知结构及性质的试样进行创造性的分离提纯时,更需要经过各种方法比较和摸索,才能找到一些工作规律和获得预期结果。其次在分离提纯工作前,常须建立相应的分析鉴定方法,以正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子,一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此,整个实验过程方法的优劣,选择条件效果的好坏,均须通过分析鉴定来判明。
另一方面,蛋白质常以与其他生物体物质结合形式存在,因此也易与这些物质结合,这给分离精制带来了困难。如极微量的金属和糖对巨大蛋白质的稳定性起决定作用,若被除去则不稳定的蛋白质结晶化的难度也随之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca 2+ ,胰岛素Zn 2+等。此外,高分子蛋白质具有一定的立体构象,相当不稳定,如前所述极易变性、变构,因此限制了分离精制的方法。通常是根据具体对象联用各种方法。为得到天然状态的蛋白质,尽量采用温和的手段,如中性、低温、避免起泡等,并还要注意防腐。注意共存成分的影响。如蝮蛇粗毒的蛋白质水解酶活性很高,在分离纯化中需引起重视。纯化蝮蛇神经毒素时,当室温超过20℃时,几乎得不到神经毒素。蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA 完全抑制,因此在进行柱层析前先将粗毒素0.1mol/LEDTA 溶液处理,即使在室温高于20℃,仍能很好的得到神经毒素。
整个制备过程一般可分为5 个阶段:①材料的选择和预处理,②细胞的破碎(有时需进行细胞器的分离),③提取,④纯化(包括盐析,有机溶剂沉淀,有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等),⑤浓缩、干燥及保存。以上5 个阶段不是要求每个方案都完整地具备,也不是每一阶段截然分开。
不论是哪一阶段使用哪一种方法,均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性。保存活性防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在,遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。因此选择的条件应为十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。

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