蛋白质组学

蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱(ESI

 

1.引言
细胞功能通常是由生物分子之间的弱相互作用即非共价作用而引起的,如酶与底物、蛋白质与配体、蛋白质与蛋白质及抗原 抗体反应。对这些弱相互作用的影响会导致疾病的发生。如ras-GDP(蛋白质-配体),γ-干扰素(蛋白质-蛋白质同源二聚体),FKBP-rapamycin(蛋白质-抑制剂复合物)。生物学家们对这些作用正进行广泛的研究以便更好地了解人体是怎样起作用的及细胞功能失常是由什么原因引起的,更重要的是如何最有效地预防这些正常过程的改变而导致的疾病。
常规用于检测非共价复合物的方法如凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示紫外光谱、荧光光谱、园二色谱、X-晶体衍射及核磁共振等。但各有各的优缺点。凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示紫外光谱、荧光光谱、园二色谱等只能表明形成复合物后蛋白质的结构发生了变化,但提供很少或不能提供关于分子 量及复合物化学计量结合数的信息。X-晶体衍射和核磁共振方法被用于测定蛋白质的三维结构,可以提供详细的结构信息。但都很费时和复杂。X-晶体衍射只有在得到合适晶体的情况下才能应用,但单晶的培养是很不容易的。核磁共振分析所用样品量很大且不能分析分子量很大的复合物(大于40KD)。随着近年来软电离技术的发展,质谱技术在蛋白质非共价复合物研究方面显示了一定的威力。
由于ESI是一项软电离技术,因此很少使分子裂解产生碎片,因此非共价复合物能够用ESI来研究。它能够在非常接近天然溶液状态的情况下研究复合物,能够更加真实地反映生物大分子的生理状态。到目前为止,用ESI观察到的不同的复合物包括蛋白质-蛋白质(1,2),蛋白质-配体(3~5),蛋白质-寡核苷酸(6,7)和蛋白质-双链DNA(8)及蛋白质-金属离子复合物(9~11)。可见,ESI-MS已广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。由于其具有灵敏度高、快速和质量精确度高的优点,结合物的化学计量比能够很容易地从分子量推导出。通过改变Cone电压、改变pH值和毛细管温度,可以比较不同化合物与蛋白质的亲合力的大小(12)。通过与部分酶解和完全酶解相结合,还可以确定小分子 与蛋白质的结合位点(13)。总之,应用ESI 研究蛋白质复合物能够在样品用量少(皮克摩尔到亚皮克摩尔),快速的情况下得到可靠的数据和较多的信息。
基于ESI的许多优点,美国一实验室已致力于发展质谱方法来研究生物大分子 非共价复合物,以便寻找一种抗癌剂。他们的策略是从合成的或天然的资源中筛选能够与致病蛋白非共价键结合的抑制剂,以便来干预致病机理(12)。该实验室自1990年开始该项目以来,已用ESI研究了ras-蛋白和其配体GDP(14)和GTP(15)的非共价相互作用。在最近的工作中,他们用ESI检测到了ras-GDP和有机抑制剂SCH54292和SCH54341的三元复合物,在三元复合物ras-GDP-SCH54292的研究中,他们还确定了药物和ras蛋白的结合位点。从上述研究可以看出,ESI-MS作为研究蛋白质非共价键复合物的工具,具有很好的应用前景。
2.电喷雾质谱(ESI-MS)的基本原理
ESI是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面积缩小,导致分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生多电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比降低到多数质量分析仪都可以检测的范围,因而大大扩张了分子量的分析范围。离子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算出,一般由计算机软件 完成。电喷雾质谱可忍受少量的盐和缓冲液,但盐和缓冲液的存在会使仪器的灵敏度降低。电喷雾质谱的优点是它可以方便地与多种分离技术联用,如液质联用和毛细管电泳-质谱联用等。
3.电喷雾质谱(ESI-MS)研究蛋白质非共价复合物的实验条件
电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物成功的关键条件是很好的理解和调节仪器参数和样品制备。一般情况下用电喷雾质谱研究蛋白质或多肽的最灵敏和最稳定条件并不适用于蛋白质非共价键复合物的研究。通常,用电喷雾质谱研究蛋白质时,样品溶于含1%HCOOH 或1%HOAc的含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。这样的条件对蛋白质形成非共价键复合物是不利的,会破坏非共价键的形成。在接近生理pH时,蛋白质保持有天然的活性构象,才能形成非共价键复合物。因此,研究蛋白质非共价键复合物时,样品常溶于2-50mM NH4Oac或NH4HCO3中,pH在5-8之间比较合适。毛细管温度或电喷雾源温的高低对蛋白质非共价键复合物也有影响。在能够使样品离子化的条件下,温度越低越好。电喷雾大气压和真空之间的电压或Cone电压对复合物也有很大的影响,电压高时会导致复合物的解离。总之,所有能够导致蛋白质变性的因素都不利于蛋白质非共价键复合物的形成。PH值、有机溶剂、温度和电压是在研究蛋白质非共价键复合物时要考虑的几个重要因素。用电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物的稳定性也常常是通过改变这几个条件来实现的。

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