蛋白质组学

冷泉港实验手册:验证蛋白DNA相互作用的功能重要性

 

7月,最新一期的冷泉港实验手册《Cold Spring Harbor Protocols》发布。按照惯例,有两篇protocol是可以免费阅读的,其中一篇介绍了如何验证蛋白-DNA相互作用的功能重要性。这篇文章节选自《真核生物的转录 调控:概念、策略与技术》一书,是由美国加州大学洛杉矶分校(UCLA)的研究人员撰写的。

鉴定与感兴趣的控制区域相互作用的DNA结合蛋白已变得相当简单。然而,特定的蛋白-DNA相互作用的功能相关性还难以建立。作者介绍了一些检验这种相关性的方法。但同时强调,没有一种实验本身是结论性的。作者介绍了每种方法所获得的信息,并解释了它为什么产生了有用但不确定的结果。就所需的劳动量和获得的信息而言,每种方法差别很大。

作者写道,鉴定与控制区域相互作用的DNA结合蛋白相对简单,但要明确特定转录因子通过与确定的控制元件结合而直接调控靶基因还是一个相当困难的任务。其中涉及到鉴定重要的DNA序列元件及与这些元件结合的蛋白的实验策略。

然而,这种鉴定并不能证明生物相关性。例如,在细胞核 提取物种检测蛋白-DNA的相互作用反映了很多因素:(1)细胞中蛋白的丰度,(2)蛋白提取的效率,(3)活性蛋白的稳定性,(4)提取过程中翻译后修饰的维持,(5)体外DNA结合分析所使用的条件,(6)蛋白与控制元件的亲和力。

作者认为,体外检测蛋白-DNA相互作用不足以说明它的体内相关性。然而,证实哺乳动物细胞内蛋白-DNA相互作用的功能重要性的明确方法尚未开发。目前大家常采用两种来开展功能相关性研究,那就是ChIP 和RNAi。

ChIP目前已成为鉴定蛋白与特定基因组区域之间关联的极为常用方法。一个严格对照的ChIP实验的阳性结果可以提供关键的信息,即一个候选蛋白确实非常靠近感兴趣的控制元件。不过,ChIP并不是一个功能分析,而仅仅显示了体内关联。因为一些研究表明,DNA结合蛋白在体内并非能激活所有DNA元件,还必须获得其他的功能相关性证据。

功能丧失(loss-of-function)研究也是目前很常用的。利用RNAi,可以快速knockdown编码几乎所有蛋白的基因的表达,只要能获得对RNAi敏感的细胞群体。不过,RNAi也无法轻松克服功能丧失研究所固有的限制,包括两个或多个因子之间冗余度所造成的差异以及很难区分直接和间接影响。

在这篇文章中,作者介绍了12种不同的方法,从ChIP和RNAi开始,它们可以检测一个特定的蛋白-DNA相互作用是否在功能上重要。他们介绍了每种方法的原理和操作,并解释了它们为什么产生了有用但不确定的结果。作者认为,如果主要目标是建立一种相互作用的功能重要性,那么应采取几种不同的方法。

这篇文章可免费阅读,地址为: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2012/7/pdb.top070060.full

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