蛋白质组学

辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG

 

一、实验目的

1. 初步掌握从血清中提取纯化IgG的方法步骤。
2. 了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。

二、实验原理

辛酸—硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白,辛酸为短链脂肪酸,在酸性条件下可沉
淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig 蛋白质;第二步利用硫酸铵盐析将Ig 沉淀下来,操作步骤如图3
-10所示。经SDS-Page 电泳检测能得到电泳纯度较高的Ig。

三、仪器、原料和试剂
仪器
磁力搅拌器、离心机 、低温冰柜。

图3—10 辛酸—硫酸铵法从血清中纯化lgG 操作流程
原料
抗血清(兔抗鸡血清)
试剂
1. 乙酸—乙酸钠缓冲液:60mmol/L,pH4.0
2. 10×磷酸盐-NaCl 缓冲液(PBS ):100mmol/LPBS,pH7.4。称NaCl 80g、Na2HPO4 12H2O 29g、KCl 2g 、KH2PO4 2g,加蒸馏水溶解,加入100mmol/LEDTA 20m1,用去离子水定容至l000mL。
3. 透析液 10mmoL/L Na2HPO4- KH2PO4缓冲液,含15mmol/LNaCl,pH7.2。
4. 硫酸铵
5. 辛酸
四、操作步骤
1.抗血清用4倍体积乙酸—乙酸钠缓冲液稀释,用0.1mol/LNaOH 调至血清稀释液为pH4.5;
2.室温下边搅拌(磁力搅拌器或电功搅拌器),边缓慢滴加辛酸(25mL/L 血清稀释液),滴加完后继续搅拌30min。
3.离心(10000r/min,30min),收集上清夜,弃去沉淀;
4.上清液用多层纱布过滤;
5.按l/10体积加入10×PBS,用5mol/LNaOH 调至PH7.4。
6.上清液4℃预冷,计算溶液总体积,在4℃按277g/L 加入硫酸铵粉沫(45%饱和度),边加边搅拌,加完后继续搅拌30min。
7.离心(5000r/min、15min),弃去上清液。收集沉淀。
8.沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10),透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。
9.Ig 溶液在50~55℃水浴中加热20min,离心(5000r/min,20min), 上清液-20℃保存或冻干保存。

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