蛋白质组学

Folin

 

一、 目的
掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法,熟悉分光光度计 的操作。
二、原理
Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂)还原,产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100 倍,定量范围为5~100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外,不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1.实验材料
绿豆芽下胚轴(也可用其它材料如面粉)
2.仪器
(1)722 型(或721 型)分光光度计
(2)4 000r/min 的离心机
(3)分析天平
(4)容量瓶(50mL)
(5)量筒
(6)移液管(0.5mL、1mL、5mL)
3.试剂(纯度均为分析纯)
(1)0. 5mol/L NaOH
(2) 试剂甲:
(A)称取10g Na2CO3,2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用蒸馏水定容至500mL。
(B)称取0.5g CuSO4·5H2O,溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将(A)液50 份与(B)液1 份,即为试剂甲,其有效期为1d,过期失效。
(3)试剂乙:
在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠(Na2WO4·2H2O)和700mL 蒸馏水,再加50mL 85 %磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀,接上回流冷凝管,以小火回流10h。回流结束后,加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15min,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色,再滴加数滴液体溴,继续沸腾15min)。然后稀释至1L,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存,使用前大约加水1 倍,使最终浓度相当于1mol/L。
四、操作步骤
1.标准曲线的制作
(1)配制标准牛血清白蛋白溶液:在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中,烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次,冲洗液一并倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,则配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。
(2)系列标准牛血清白蛋白溶液的配制:取6 支普通试管,按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL,混合后在室温下放置10min,再各加0.5 试剂乙,立即混合均匀(这一步速度要快,否则会使显色程度减弱)。30min 后,以不含蛋白质的1 号试管为对照,用722 型分光光度计 于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。

(1)标准曲线的绘制:以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品的提取及测定
(1)准确称取绿豆芽下胚轴1g,放入研钵中,加蒸馏水2mL,研磨匀浆。将匀浆转入离心管,并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管,离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL 容量瓶中,用蒸馏水定容到刻度,作为待测液备用。
(2)取普通试管2 支,各加入待测溶液1mL,分别加入试剂甲5mL,混匀后放置10min,再各加试剂乙0.5mL,迅速混匀,室温放置30min,于650nm 波长下测定光密度,并记录结果。
五、结果计算
计算出两重复样品光密度的平均值,从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X(μg),再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。

六、附注
(1)进行测定时,加Folin 试剂要特别小心,因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定,但此实验的反应只是在pH10 的情况下发生,所以当加试剂乙(Folin 试剂)时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
(2)本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。
七、思考题
1.含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应?
2.测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外,还可以用什么方法?
参考答案
1.含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)能与Folin-酚试剂反应呈蓝色,因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钼兰和钨兰混合物)。
2.除Folin-酚试剂显色法以外,紫外吸收法也可以进行蛋白质含量的测定。蛋白质在280nm 下具有最大的吸收值,这是由于含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的。若将已知不同浓度的蛋白质在280nm 处测定,并作标准曲线,即可求得未知溶液的蛋白质浓度。

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